Université Dr Moulay Tahar Saida. Dr Belgacem Habiba
Département des Sciences de la Nature et de la Vie
Master 1 Microbiologie Appliquée
TP n° 0 2. Réaliser une Chromatographie sur colonne
Principe et description
Cette méthode est fondée essentiellement sur les phénomènes d’adsorptions. Une colonne de différentes dimensions est remplit de la phase fixe (alumine ou silice), l’échantillon, mis au sommeille de la colonne, est entrainé à l’intérieur grâce à l’écoulement de l’éluant le long de la colonne en résultant, ainsi, la séparation des particules. Le déplacement de l’éluant (un seul solvants ou mélange) est effectué par gravité ou sous l’influence d’une faible pression externe. Les particules se répartissent dans la colonne selon leur affinité pour la phase fixe et leur solubilité dans la phase mobile. Chaque particule sortante doit être recueillit.
1. Facteurs influant la séparation
Les quatre paramètres intervenant dans la séparation et l’isolement des particules sont : l’adsorbant, l’éluant, les dimensions de la colonne et la vitesse d’élution.
a. Adsorbant : les adsorbants les plus utilisés pour préparer la phase stationnaire sont le gel de silice (SiO2) et l’alumine (Al2O3). - Alumine : puissant, utilisé pour l’adsorption des composés organique stables, à savoir : les hydrocarbures aromatiques et insaturés, les caroténoïdes, les stéroïdes, les alcaloïdes et les acides aminés. Il représente quelques inconvénients qui expliquent en grande partie l'utilisation préférée du gel de silice. - Gel de silice : une poudre blanche utilisée principalement pour séparer les composés organiques instable ou possèdent une stabilité insuffisante pour être adsorbés sur alumine.
b. Eluant : doit être soluble et interagir avec les particules de l’échantillon et non pas avec l’adsorbant. Il est souvent un mélange de solvant (polarité accroitre au cours de l’opération) qui se déplace le long de la colonne en entrainant avec lui les particules de l’échantillon.
c. Dimension de la colonne : la colonne est le support de l’adsorbant et à travers laquelle l’éluant passe (verre, plastique ou inox). Généralement, les colonnes préparées pour cet usage ont à leur base une plaque de verre fritté qui permet l’élution de la phase mobile tout en empêchant le passage de la phase stationnaire. (Fig. 03).
Figure 03: Colonne classique
d. Vitesse d’élution : doit être plus constante possible. Pour une bonne séparation, les particules à séparer doit être plus près de l’équilibre (en équilibre) entre les deux phases et donc la vitesse doit être suffisamment lente. Elle ne doit pas trop lente ou trop rapide.
2. Remplissage de la colonne
Le remplissage de la colonne doit être effectué avec soin et la phase stationnaire doit totalement tasser et dépourvu des bulles d’air ou fissures. Les deux surfaces de l’adsorbant doivent être parfaitement uniformes et horizontales.
2.1. Introduction de l'échantillon
Les échantillons sont mis au sommeille de la colonne tel quel, alors que ceux solides doivent dissoudre dans un petit volume du solvant le moins polaire de deux solvants. Il doit être coulé soigneusement au sommeille, en une seule fois pour éviter toute turbulence et former une couche cylindrique, fine et uniforme (robinet fermé). Ensuite, le robinet est ouvert un court temps pour que l’échantillon puisse pénétrer dans l’adsorbant.
2.2. Développement ou élution
L’alimentation en solvant est faite manuellement ou avec une ampoule de coulée. Au cours de la chromatographie, la surface de l’adsorbant ne doit être jamais en contact avec l’air, et on doit s’assurer que le débit de l’alimentation en solvant est le même que celui de l’élution (Fig. 04). On recueillit les fractions séparées dans des flacons et les conservées pour l’analyse. Figure 04: Schéma d’une colonne chromatographique classique
Figure 04: Schéma d’une colonne chromatographique classique