La multiplication de la construction génétique : le clonage
Afin d’avoir plusieurs copies d’un gène d’interêt, les plasmides (petites molécules d’ADN circulaires des bactéries, en plus de l’unique chromosome) sont exploités pour intégrer la construction génétique, ils possèdent plusieurs sites de restriction. Il s’agit ainsi d’un plasmide recombiné qui sera ensuite réintégré dans des bactéries hôte, généralement Escherichia coli.
La culture de cette bactérie permettra la multiplication: c’est le clonage du gène ou de la construction génétique.
L’utilisation d’Agrobacterium (figure 5)
Agrobacterium tumefaciens transfert naturellement une partie de son plasmide: ADN-T (ADN Transféré) dans les chromosomes de la plante, l’ADN-T est délimité par des séquences de 25 nucléotides.
La modification du plasmide Ti permet le transfert et l’intégration des gènes désirés dans le génome des plantes, par reconstruction de plasmides Ti désarmés: délétion des gènes de pathogénicité + conservation des bordure droite et gauche de l’ADN-T
Obtention d’une variété d’OGM
Une fois le gène d’interêt introduit, il faut s’assurer que la plante l’a bien intégré dans son génome par des analyses moléculaires. Ensuite voir si le gène introduit s’exprime et produit la protéine désirée, en quantité suffisante, par des analyses biochimiques. A cette étape, de nombreuses plantes transgéniques seront éliminées par défaut d’expression du gène d’intérêt.
La sélection des cellules sur un milieu contenant l’agent de sélection (gène marqueur) n’est pas suffisamment fiable. Certaines cellules, bien que non transformées, parviennent quand même à se développer sur le milieu de sélection.
*Analyses moléculaires
Test de la PCR (figure 6)
La présence du transgéne peut être détectée sur d’infimes quantités d’ADN par la PCR (Polymerase Chain Reaction), réaction de polymérisation en chaîne, et ce par des amorces spécifiques, elle permet également de suivre la transmission du nouveau gène dans la descendance. Les fragments amplifiés sont visualisés par migration sur un gel et leur taille est comparée à celle du fragment attendu. Ainsi sur la figure 6, seules les plantes B et D possèdent un fragment pouvant correspondre au gène d’intérêt transféré.
Pour caractériser si ce gène s’exprime, la PCR reverse (RT-PCR) permet de vérifier la présence d’ARN messager, transcrit spécifiquement à partir du gène introduit.
Test par la technique de Southern
Une analyse plus fine pourra ensuite être réalisée par hybridation moléculaire ADN-ADN, selon la technique de Southern.
Seule l’hybridation spécifique permet de démontrer que le gène transféré est intégré dans le génome. L’ADN total de la plante est digéré séparément par différentes enzymes de restriction. Les fragments d’ADN ainsi obtenus sont séparés par électrophorèse. Ils sont ensuite transférés par capillarité sur une membrane en nylon. Enfin, une hybridation à l’aide d’une sonde marquée (correspondant à tout ou une partie du gène transféré) permettra de déterminer le nombre de copies du transgène intégrées au génome de la plante. Ainsi dans le cas des plantes B et D, B possède une seule copie et D trois copies.
* Analyses biochimiques
Le test Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, Immuno-essais avec couplage enzymatique) permet de déterminer si le gène d’interêt produit ou non la protéine désirée et en quelle quantité, ce test permet de tester la présence et l’activité de la protéine.
*Evaluation de la valeur agronomique de la plante
L’activité du gène étranger peut interférer avec le métabolisme général de la plante, des tests en serre et en champ sont alors effectués afin de verifier si le gène introduit confère le caractère souhaité, il s’agit donc de voir si le potentiel de la plante n’est pas atteint.
Il est également important d’observer le comportement au champ des plantes transgéniques et s’il correspond à celui attendu sur la base des observations effectuées en serre sur quelques plantes. Ceci permet d’évaluer le niveau et la stabilité de l’expression du caractère dans différentes conditions de culture, seules quelques plantes seront retenues.