Université de Saida Dr Moulay Tahar .                                                                                                       Dr Belgacem Habiba

Département de biologie

Année universitaire 2024-2025
Master 1 Microbiologie Appliquée

 

TP n° 01. Réaliser une Chromatographie sur Couche Mince (CCM).

     Objectif de la Manipulation

 L’expérience consiste à essayer de séparer les différentes composées de l’extrait méthanolique de l’Actinomycète afin de les identifier.

     A. Principe :

 La chromatographie procédé d’analyse immédiate, sert à séparer des constituants d’un échantillon. Elle est utilisée en analyse pour quantifier et identifier des molécules dans un mélange.

La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque d’aluminium.

Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent essentiellement par capillarité à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.

Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.

      B. L’appareillage :

• La cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.
• La phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l’aide d’un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris), l’amidon ou un polymère organique.
• L’échantillon : environ un microlitre (μl) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.
• L’éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l’échantillon.

                                                         Figure 01 : Montage de la chromatographie sur couche mince

C. Dépôt de l’échantillon :

• -L’échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, comme le trichlorométhane (chloroforme), la propanone ou le dichlorométhane. La solution est déposée en un point de la plaque situé à environ 1 cm de la partie inférieure.
• -Il est important que le diamètre de la tâche ne dépasse pas 3 mm. Ce sont généralement les dépôts les moins étalés qui permettent les meilleures séparations.
• L’échantillon est déposé à l’aide d’une micropipette ou d’un tube capillaire

D. Développement de la plaque :

-la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant qui en recouvre le fond monte par capillarité.

-Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve puis on introduit la plaque. Pendant le développement du chromatogramme, la cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée.

-Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de l’extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée à l’air libre ou à l’aide d’un séchoir.

E. Révélation :

Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont colorés, leur séparation est facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches visibles par un procédé de révélation. Les taches sont ensuite cerclées au crayon. Les méthodes usuelles de révélation sont les suivantes :

A l’oeil nu : le cas d’un produit coloré

Radiation UV : en exposant la plaque à une source de radiation UV, certains composés apparaissent sous formes de tache brillantes.

Fluorescence : si un indicateur de fluorescence est incorporé à l’adsorbant ; la plaque entière devient fluorescente lorsqu’elle est soumise à radiation UV. Les composés sont révélés sous forme de taches sombres.

Iode : l’iode réagit avec un grand nombre de composé organique en formant des complexes jaunes. La révélation est réalisée en mettant la plaque, préalablement séchée en présence de quelque cristaux d’iode dans un récipient; fermé ensuite pour saturé de vapeur.

                                                                                    

Figure 02 : Chromatographie sur couche mince de l’extrait brut de l’isolat en utilisant le système de solvants 

(Acétate d’éthyle / Méthanol 100 : 15).

 

         Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal) :

                                                                             

                                                                            Figure 3 : Exemple d’élution en CCM

     d : distance parcourue par le composé (mesuré au centre de la tache)

     D : distance parcourue par le front du solvant

    Nous déterminerons ensuite, le ratio frontal Rf = d/D , ce dernier étant le rapport entre

    la distance  parcourue par le soluté, divisé par la distance parcourue par le front du solvant.

    Ce paramètre, nous informera sur la bonne séparation des composés.

 

 

 

 

 

 

2024-2025