Définition
Ce qui permettait de distinguer les individus était leur phénotype (caractères observables), actuellement, des techniques de biologie moléculaire, permettent de lire partiellement le génotype d'un individu, et d'étudier la diversité génétique au niveau du génome, ces techniques sont le marquage moléculaire.
Les marqueurs génétiques renseignent sur le génotype d'un individu et ne sont pas modifiés par l'environnement.Ils peuvent être utilisés tout au long d'une expérimentation et sont observables à n'importe quel stade de développement de la plante et sur n'importe quel organe. Les principaux types de marqueurs génétiques utilisés sont :
- Les marqueurs biochimiques (isozyme, protéine). Les protéines d'une cellule végétale peuvent facilement être extraites et analysées. Les marqueurs biochimiques les plus utilisés sont les isozymes. Ils correspondent aux différentes formes d'une même enzyme et permettent de déterminer la présence de l'allèle correspondant à chacune de ces formes. Dans ce sens, ce sont des révélateurs du polymorphisme entre individus pour les séquences codantes du génome.
- Les marqueurs moléculaires d'ADN. Ce sont les plus étudiés. Ces marqueurs sont des séquences codantes ou non, présentant un polymorphisme selon les individus. Par les techniques de biologie moléculaire, plusieurs outils ont été développés, permettant d'obtenir directement à partir des marqueurs polymorphes de l'ADN des plantes. Les plus utilisés sont les marqueurs RFLP, RAPD, AFLP et les microsatellites.
- Les marqueurs RFLP (Polymorphisme de longueur de fragment de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Un polymorphisme est toute modification des séquences d’ADN soit par mutation, addition ou délétion, les sites de restrictions sont alors modifiés et ainsi après l’action des enzymes de restriction, la taille des fragments de restriction est différente.
Les étapes de la technique
- L'ADN de la plante est extrait.
- Il est soumis à une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction. La taille des fragments obtenus est dépendante des enzymes utilisées.
- Les fragments sont ensuite séparés selon leur taille par électrophorèse. Lors de la digestion de l'ADN génomique, on visualise sur le gel une traînée appelée « smear », car il y a un grand nombre de fragments impossibles à séparer.
- L'ADN est transféré par capillarité sous forme dénaturée (simple brin) sur une membrane de nylon. Cette technique de transfert permet de conserver la position relative des fragments d'ADN.
- Cette membrane est mise en contact avec une solution contenant une sonde marquée soit par la radioactivité, soit chimiquement. Cette sonde s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN avec lesquels elle présente une homologie.
- La position de l'hybridation est révélée en plaçant la membrane au contact d'un film sensible, ou en réalisant une réaction enzymatique colorée (selon le type de sonde utilisé).
Ces trois dernières étapes de transfert, d'hybridation et de révélation correspondent à la technique de Southern.