Université Dr Moulay Tahar Saida.                                                                                                                                  Dr Belgacem Habiba

Département des Sciences de la Nature et de la Vie

Master 1 Microbiologie Appliquée

TP 04 : Dosage d'une suspension bactérienne par spectrophotométrie

    Objectif :

    Matériel :

- Spectrophotomètre UV-visible réglé sur 600 nm

- Cuvettes en plastique (si la longueur d'onde est ≥ 400 nm) ou en quartz

- Suspension bactérienne (ex. : *Escherichia coli*)

- Milieu de culture (ex. : LB, bouillon nutritif)

- Solution tampon (ex. : NaCl 0,9 %) pour les dilutions, si nécessaire

- Pipettes automatiques

-Tubes à essais ou microplaque

   Principe :

  La mesure de l'absorbance d'une suspension bactérienne permet de quantifier la densité cellulaire en fonction de la turbidité de la solution, qui    augmente proportionnellement à la concentration de bactéries. À 600 nm, cette absorbance (DO 600) est utilisée pour estimer la concentration    de bactéries vivantes. La relation linéaire entre l'DO 600 et la concentration en CFU/mL est validée par la loi de La relation entre l'absorbance et    la concentration de cellules suit la loi de Beer-Lambert :

UN= ε⋅l⋅C                                                    où :

   UN : est l'absorbance (sans unité),

   ε : le coefficient d'extinction molaire (en L.mol⁻¹.cm⁻¹),

   l : est la longueur de la cuvette (généralement 1 cm),

   C : est la concentration de cellules (en unités appropriées, par exemple CFU/mL).

                                                                              

                                                                                 Figure 01: Schéma de principe du spectromètre UV-visible

   Protocole :

    1. Préparation de la culture bactérienne :

Ensemencer un milieu de culture (par exemple, 10 mL de LB) avec une souche bactérienne fraiche (par exemple, E. coli )

Incuber la culture bactérienne à 37 °C sous agitation jusqu'à obtention d'une densité cellulaire suffisante (en phase exponentielle si l'objectif est d'observer la croissance)

     2. Préparation des solutions étalons (optionnelles) :

• Préparer une série de dilutions de la suspension bactérienne pour établir une courbe d'étalonnage (par exemple, dilutions 1:10, 1:100, 1:1000, etc.) dans un tampon (ex. NaCl 0,9 %) ou un milieu stérile.

 Pour chaque dilution, effectuer des étalements en boîte et compter les colonies après incubation pour calculer le nombre de CFU/mL     correspondant à chaque dilution.

      3. Préparation des dilutions de suspension microbienne

 Dilutions de raison connue d’une culture microbienne

 Mesure de l’atténuance à une longueur d’onde adaptée (600 ou  650 nm)

 À partir de la culture de 18 heures, réaliser la gamme de dilution suivante dans 8 semi-microcuves et en milieu BN stérile :

    4. Mesure de l'absorbance (DO 600) :

• Allumer le spectrophotomètre et le régler à 600 nm.
• Ajuster le blanc avec un échantillon de milieu de culture (sans bactéries)
• Prélever un volume d'échantillon (par exemple, 1 mL) de la suspension bactérienne et le placer dans la cuve
• Mesurer l'absorbance à 600 nm et noter la valeur d'DO de chaque dilution.
• Si l'absorbance dépasse 1,effectuer des dilutions de la suspension pour revenir dans une plage de mesure linéaire (typiquement, DO600  < 1).

     5. Tracé de la courbe d'étalonnage (si applicable) :

• Tracer la courbe de l'absorbance UN en fonction de la concentration de cellules C 
• (CFU/mL) pour les dilutions étalons.

• Utiliser une droite de régression linéaire pour ajuster les données.

      Cette courbe permet de convertir les mesures d'DO600 en concentration bactérienne pour la culture

   6. Dosage de la suspension inconnue :

       Mesurer l'absorbance de la suspension inconnue à 600 nm.

       Reporter cette valeur sur la courbe d'étalonnage pour déterminer la concentration en bactéries.

   7. Suivi de la croissance bactérienne (optionnel) :

      Prélever des échantillons de la culture à différents temps d'incubation (par exemple, toutes les 2 heures).

      Mesurer l'DO600 pour chaque prélèvement.

      Tracer la courbe de croissance en fonction du temps, qui montre typiquement les phases de latence, exponentielle, stationnaire et déclin.

   8. Résultats :

      1. Tableau des résultats :

Dilution	Concentration (UFC/mL)	Absorbance (A600)
1:10
1:100
1:1000

    2. Graphique :

Tracer le graphique de l'absorbance UN en fonction de la concentration des dilutions étalons.

    Exemple : 

Atténuance d’une souche bactérienne de Staphylococcus epidermidis en concentration croissante par turbidimétrie

  Discussion :

Comparer la concentration déterminée à des valeurs attendues, si disponibles.

Discuter des sources d'erreur potentielles, telles que la précision dans la préparation des dilutions, la calibration du spectrophotomètre ou des variations dans l'optique de la cuvette.

Évaluer l'importance de cette méthode pour le suivi de la croissance bactérienne dans les cultures, les applications en biotechnologie ou la recherche microbiologique.

   Conclusion :

Présenter la concentration bactérienne finale de l'échantillon dosé et discuter de l'importance de ce type de mesure dans les études microbiologiques, notamment pour le contrôle de la croissance bactérienne ou la préparation de milieux de culture standardisés pour des expériences.