Dr Belgacem Habiba
Université DR Moulay Tahar Saida.
Département Des Sciences De la Nature et de La vie
Master 1 Microbiologie Appliquée
TP n° 06 : Analyse des acides nucléiques et des protéines par électrophorèse
Ce TP se concentre sur l'électrophorèse sur gel d'agarose pour l'analyse de l'ADN et l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) pour les protéines.
Objectifs :
1. Comprendre les principes fondamentaux de l'électrophorèse.
2. Maîtriser la préparation et l'utilisation de gels d'agarose pour l'ADN.
3. Utiliser le SDS-PAGE pour séparer les protéines selon leur masse moléculaire.
4. Interpréter les résultats pour identifier les échantillons.
Partie 1 : Électrophorèse sur gel d'agarose
Matériel requis :
- Agarose
- Tampon TAE ou TBE (50X pour dilution)
- Bromure d'éthidium ou GelRed (pour la coloration de l’ADN)
- Échantillons d'ADN (ex. : ADN plasmidique ou génomique, ladder d'ADN)
- Micropipettes et cônes stériles
- Bain-marie ou micro-ondes
- Plateforme d'électrophorèse et alimentation électrique
- UV transilluminateur
Protocoles expérimentaux :
Préparation du gel d’agarose
- Dissoudre 1 g d’agarose dans 100 mL de tampon TAE 1X (1% agarose) dans un bécher.
- Chauffer au micro-ondes jusqu’à dissolution complète.
- Laisser refroidir à 50-60°C, ajouter 5 µL de bromure d'éthidium (ou GelRed), mélanger doucement.
- Verser dans un plateau à gel équipé de peignes et laisser solidifier (30 min).
2. Préparation des échantillons d'ADN
- Mélanger chaque échantillon d'ADN avec 1 volume de tampon de charge (loading dye).
- Préparer un ladder d’ADN (marqueur moléculaire).
3. Chargement et migration
- Remplir la cuve d'électrophorèse avec du tampon TAE 1X.
- Charger les puits avec 10 µL d’échantillons d’ADN.
- Lancer la migration à 100 V pendant 30-45 minutes.
4. Visualisation
- Observer le gel sous UV pour identifier les bandes d'ADN.
- Comparer les bandes avec le ladder pour estimer la taille des fragments.
Résultats attendus :
- Des bandes fluorescentes correspondant aux fragments d’ADN.
- Une séparation nette selon la taille moléculaire.
Partie 2 : SDS-PAGE pour les protéines
Matériel requis :
- Kit de SDS-PAGE (gel de polyacrylamide à 12%, pré-coulé ou à préparer)
- Tampon Tris-Glycine SDS 1X
- Tampon de charge des protéines (La emmli buffer)
- Échantillons protéiques (ex. : lysats bactériens, ladder de protéines)
- β-mercapto éthanol ou DTT
- Cuve d'électrophorèse et alimentation électrique
- Colorant (ex. : bleu de Coomassie)
Protocoles expérimentaux :
1. Préparation des échantillons protéiques
- Mélanger 20 µL d’échantillon avec 5 µL de tampon Laemmli contenant du β-mercapto éthanol.
- Chauffer à 95°C pendant 5 min pour dénaturer les protéines.
2. Préparation et montage du gel
- Préparer un gel de polyacrylamide à 12% (ou utiliser un gel pré-coulé).
- Monter le gel dans la cuve et remplir la cuve avec du tampon Tris-Glycine SDS 1X.
3. Chargement et migration
- Charger 10-20 µL d’échantillon dans les puits.
- Inclure un ladder de protéines pour l'étalonnage.
- Faire migrer les échantillons à 120 V pendant 1-2 h.
4. Coloration du gel
- Plonger le gel dans une solution de bleu de Coomassie pendant 30 min.
- Décolorer avec une solution d’éthanol/acide acétique pour visualiser les bandes.
Résultats attendus :
- Des bandes correspondant aux protéines séparées selon leur masse moléculaire.
- Identification des protéines cibles par comparaison avec le ladder.
Analyse des résultats :
- Calculer la taille des fragments d'ADN en fonction de la distance migrée.
- Estimer la masse moléculaire des protéines en comparant les bandes avec le ladder.
- Discuter des éventuelles anomalies (ex. : contamination, surcharges).
Conclusion et questions :
1. Quel est l'effet de la concentration en agarose sur la résolution des fragments d’ADN ?
2. Pourquoi utilise-t-on le SDS dans l’électrophorèse des protéines ?
3. Comment améliorer la résolution des protéines dans un gel SDS-PAGE ?
Dr Belgacem Habiba