La dialyse est une technique qui permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane appelée membrane de dialyse.

1.1. Principes généraux

Les membranes de dialyse habituellement utilisées en biochimie se présentent sous forme de cylindres allongés qu’il faut fermer aux deux extrémités et qui contiennent le liquide à dialyser. Ce cylindre prend alors le nom de « boudin » de dialyse. Il est placé dans un récipient contenant le liquide contre lequel s’effectue la dialyse ou liquide de contre-dialyse. (Figure 01)

 

Figure 01 : Schéma générale d’une dialyse

1.2. Les membranes

On  utilise des membranes en collodion de préparation extemporanée et, actuellement, surtout des tubes de cellophane. Les plus utilisées sont les membranes Visking dont les tailles des pores sont de 2,4 nm (elles laissent passer la ribonucléase pancréatique de diamètre moyen 1,9nm (poids moléculaire 25 000 daltons). Suivant la largeur à plat des cylindres on distingue :

 

            La porosité de ces membranes peut être modifiée par étirement dans le sens longitudinal ou par traitement chimique (acétylation ou action du chlorure de zinc à forte concentration).

1.3. Facteurs influençant la dialyse 

Une membrane de dialyse ne doit pas être chargée électriquement afin de minimiser les phénomènes  parasites  qui  pourraient survenir (répulsion par charge identique ou adsorption sur la membrane s’élève avec l’augmentation de la température qui amplifie l’agitation des molécules et augmente ainsi la probabilité pour une molécule donnée de traverser la membrane. Un facteur important, pouvant modifier considérablement la vitesse de dialyse, est le rapport surface de la membrane/volume de la solution à dialyser.

Pour un volume donné de solution à dialyser, la vitesse augmente avec la surface de la membrane (voir plus loin l’application de la dialyse). La dialyse dépend également du pH du liquide à dialyser et surtout de celui de la contre-dialyse : il n y a pas de règle précise car suivant la nature des molécules, dialysables ou non dialysables, l’apparition de charges électriques sur la molécule peut ou non ralentir la vitesse de la dialyse.

De nombreuses substances peuvent modifier la vitesse de dialyse : ainsi une molécule polypeptidique, l’adréno corticotrophine (ou A.C.T.H), hormone de l’hypophyse antérieure, dialyse contre de l’eau distillée. Si l’eau est remplacée par une solution d’acétate d’ammonium 0,15 M la dialyse est pratiquement inhibée. Souvent ces modifications de vitesse de dialyse sont dues à l’apparition d’agrégats non dialysables. Ceci peut être déterminé par l’étude de la courbe de vitesse de dialyse (Figure 02). L’aspect schématisé en A indique l’absence d’agrégats, en B et C la cassure de la droite indique la présence de plusieurs formes moléculaires d’une même substance (il faut noter que l’aspect d’une courbe de dialyse est celle d’une exponentielle et qu’il est nécessaire pour linéariser le phénomène le phénomène d’utiliser une représentation semi-logarithmique). L’addition de certaines substances comme l’urée peut modifier la vitesse de dialyse de nombreuses substances (en général dans le sens d’une augmentation) ; en effet l’urée agit sur les molécules protéiques en dissociant des structures spatiales ce qui diminue le rayon apparent de la molécule.

On caractérise souvent la dialysance d’une molécule dans des conditions bien définies de surface de membrane, de pH, de température, de concentration ionique etc…, par le temps de demi-dialysance : temps au bout duquel la concentration de la molécule étudiée a diminué de moitié dans le boudin de dialyse (Figure 03)  augmente par passage d’eau de la contre-dialyse vers le boudin. Ce phénomène est dû à la pression oncotique des protéines (la fixation d’ions minéraux par les protéines et l’équilibre des charges électriques de part et d’autre de la membrane créent une pression osmotique plus élevée dans le compartiment contenant les protéines). Dans l’établissement d’une courbe de vitesse de dialyse, ces modifications de volume doivent être mesurées afin de corriger les résultats bruts.

Figure 02 : Etude de la dialyse en fonction du temps

 

Figure 03 : Mesure du temps de demi-dialysance

 

1.4. Techniques de dialyse

1.4.1. Préparation des membranes de dialyse 

Les membranes de dialyse contiennent glycérine, composés sulfurés et des métaux lourds qu’il faut préalablement éliminer par trempage. La technique usuelle consiste à placer successivement les membranes d’une heure dans la solution de bicarbonate de sodium 10mM, une heure dans une solution diluée d’EDTA (éthylène diamine tétra acétate : agent fixant par chélation les métaux lourds), puis dans l’eau distillée. La membrane ainsi préparée peut être conservée à 4 °C pendant deux à trois jours dans l’eau. Si le délai de conservation est plus long, if  faut ajouter un inhibiteur de pousse bactérienne (solution d’azide de sodium) ; si le tube se dessèche il devient alors inutilisable. Avant utilisation il faut rincer la membrane avec le solvant utilisé pour la dialyse.

1.4.2. Préparation des boudins de dialyse 

Il faut fermer les boudins à leurs deux extrémités par un nœud simple avec un retour lui-même fermé par un second nœud formé par le fil même qui a servi à serrer le premier nœud. Afin d’immerger complètement le boudin dans le liquide de contre-dialyse, il faut le lester avec des billes de verre placées dans le retour (Figure 04). Ceci permet d’éviter qu’il ne flotte à la surface du liquide de contre-dialyse car dans ce cas la surface de contact serait restreinte provoquant ainsi une diminution de la vitesse de dialyse.

Il faut assurer une agitation convenable du liquide de contre-dialyse afin d’éviter la formation de gradients de concentration des substances diffusibles dans le b écher qui contient habituellement le liquide de contre-dialyse. Ceci est particulièrement utile lorsque le volume du liquide de contre-dialyse est important. Ce liquide doit être renouvelé fréquemment afin d’accélérer dans le boudin la disparition des substances diffusibles.

Figure 04 : Fermeture des boudins de dialyse

 1.4.3. Montages spéciaux 

1.4.3.1. Dialyse circulaire

Le montage décrit permet de une dialyse rapide (débit du liquide de contre-dialyse : 2 ml /minute) le liquide de contre-dialyse coule le long du boudin. L’enceinte doit être saturée par de la vapeur d’eau afin d’éviter que des phénomènes d’évaporation ne concentrent éventuellement la solution tampon utilisée pour la contre-dialyse (Figure 05).

Figure 05 : Dialyse circulaire

1.4.3.2. Dialyse sur grands volumes

Il est alors intéressant d’utiliser un système à flux continu (par exemple, un dialyseur utilisé en analyse automatique). Le liquide à dialyser passe au contact du liquide de contre-dialyse dont il n’est séparé que par une membrane : la dialyse s’effectue sur une grande surface. Le liquide de contre-dialyse est renouvlé en permanence alors que le liquide de dialyse repasse sans cesse dans le système grâce à une pompe péristaltique (Figure 06).

   

Figure 06 : Dialyse en flux continu

1.4.3.3. Dialyse sur petits volumes

Afin d’augmenter la surface de dialyse, on introduit dans le boudin un tube de verre lesté par du mercure et fermé à ses deux extrémités. Le tube occupe la plus grande partie du volume du boudin et le liquide à dialyser est ainsi en contact sur une plus grande surface avec le liquide de contre-dialyse par l’intermédiaire de la membrane (Figure 07).

 

 

                                    Figure 07 : Dialyse sur des petits volumes

1.4.3.4. Dialyse à volume constant

Le montage décrit permet d’appliquer une pression positive sur le liquide à dialyser. Cette pression peut compenser la pression oncotique des protéines et empêche ainsi l’augmentation de volume normalement observée dans ce cas (Figure 08).

Figure 08 : Dialyse à volume constant

1.4.3.4. Electrodialyse

Technique de séparation analogue à la dialyse mais utilisant un champ électrique pour améliorer le transport des ions à travers la membrane. L’établissement d’un courant de quelques mA permet le passage des anions vers la cathode et des cations vers l’anode. Les ions minéraux sont ainsi éliminés sans perte de produits organiques.

            L’opération a lieu dans une cuve à trois compartiments (Figure 09). Le compartiment central servant à contenir le liquide à traiter, est séparé, par une membrane hémiperméable, des deux compartiments latéraux contenant l’un une anode (milieu anodique), l’autre une cathode (milieu cathodique). Ainsi, les anions et les cations, attirés par les électrodes correspondantes sont éliminés et se concentrent à l'extérieur du milieu à traiter. Une tension de quelques volts, 2 volts en général, est suffisante.

Figure 09: Principe de l’électrodialyse.

L’électrodialyse est utilisée dans la déminéralisation et la désacidification en industrie laitière. L’élévation thermique produite par le courant ne permet pas cette utilisation avec des produits thermolabiles.

1.4.3.4. A. Osmose 

L’osmose est un phénomène physique au cours duquel il se produit un flux d’eau entre deux solutions de concentrations moléculaires différentes séparées par une membrane hémiperméable, de telle façons que le solvant aqueux phase de la solution la moins concentrée vers la plus concentrée jusqu’à ce que la pression exercée sur la solution la plus concentrée atteigne une valeur appelée pression osmotique (Po), le (ou les) soluté (s) ne pouvant changer de compartiment.

            La concentration peut aussi obtenue par osmose si la membrane est imperméable aux solutés. C’est le cas de la dialyse contre une solution macromoléculaire telle que des solutions de polyvinylpyrrolidone (PVP) ou de polyéthylène glycol (PEG). On préfère le PEG que l’on peut trouver dans le commerce à des poids moléculaire moyens de 30 000 ce qui limite d’autant leur diffusion dans le liquide que l’on concentre. La qualité de liquide à concentrer est mise dans le boudin cellulosique qui est mis à dialyser pour une durée variant de 4h à 24h, suivant le coefficient de concentration désiré dans une solution de PEG à 60%. La concentration est faite généralement à 4 °C. Par ce moyen, le passage du PEG dans le concentrat est limité au maximum. Il est essentiel de noter soigneusement la quantité de liquide avant et après concentration pour établir le facteur de concentration.

1.4.3.4. B. Osmose inverse 

Technique de séparation très fine basée sur le transfert d’eau, entre deux solutions de concentrations différentes séparées par une membrane semi- perméable, se faisant à « l’envers » cous l’effet d’une pression osmotique artificielle (30 à 80 bras) qui contrarie le flux osmotique naturel de la solution la plus concentrée à la moins concentrée, laissant au passage les particules contaminantes de faible poids moléculaire (solides dissous, bactéries, etc.) (Figure 10). La pression osmotique est d’autant plus importante que la concentration est élevée et que la masse molaire est faible. La concentration a lieu sans élévation de température. Le faible débit de cette méthode peut être compensé par l’utilisation de filtres de grandes surfaces.

Les membranes utilisées ont un seuil de coupure compris entre 150 et 1000Da. Deux types de membranes sont utilisés :

·         Les membranes cellulosiques : très perméables et très sélective, mais sont sensibles à l’hydrolyse chimique. On ne les utilise qu’à des températures inférieures à 40 °C et dans une zone de pH de 3 à 8. On peut les utiliser jusqu’à 60 bars environ.

·         Les membranes en polymères organiques, surtout des polysulfones qui résistent à des pH extrêmes et à des températures de 70 °C. Le flux est limité à 150 l/h/m². On utilise également des membranes en polyamide qui éliminent 90 à 98% des éléments inorganiques, des éléments non ioniques et des molécules organiques dont la masse moléculaire est supérieur à 100 Da.

Figure 10 : Principe de l’osmose inverse.

1.5. Application de la dialyse 

Elles sont multiples : l’électrodialyse permet de dessaler des échantillons avant de réaliser des chromatographies sur papier. La dialyse par boudin permet par exemple les opérations suivantes :

*        Eliminer des produits diffusibles, (NH₄)₂SO₄ par exemple), contenus dans des solutions.

*        Equilibrer une solution protéique avec un tampon qui modifie le pH de la solution protéique.

*        Inversement, apporter dans une solution protéique une substance diffusible placée dans un boudin de dialyse : il est ainsi possible d’apporter progressivement des molécules de (NH₄)₂SO₄ dans une solution de protéines.

*        Concentrer une solution protéique soit en plaçant le boudin de dialyse contenant cette solution dans un courant d’air, soit en plaçant le boudin dans du polyéthylène glycol en poudre. L’eau quitte le boudin pour solubiliser le polyéthylène glycol qui, non diffusible, ne pénètre donc pas dans la solution protéique.

*        Dessalement des eaux saumâtres.

*        En industrie laitière : concentration du lactosérum, du lait écrémé et du lait entier,

*        Concentration des substances actives (antibiotique, acides aminés, vitamines, etc.),

*        Purification et concentration des arômes naturelles,

*        Concentration des jus de fruits,

*        Pratique médicale.