2. (ISO) ELECTROFOCALISATION

La  focalisation électrique ou isoélectrofocalisation (IEF) est une méthode de séparation des protéines en fonction de leurs points isoélectriques (valeur de pH à laquelle la molécule ne présente aucune charge nette). 

L’IEF  est  pratiquée  sur  lame  ou  sur  colonne,  dans  lesquelles  un  gradient  de  pH  est préétabli.  Le  gradient  de  pH  est  réalisé  en  imprégnant  le  gel  avec  un  mélange  de  substances amphotères de points isoélectriques différents. Lorsque la différence de potentiel est appliquée, les  différents  ampholytes  se  rangent  dans  l’ordre  de  leur  point  isoélectrique  et  réalisent  un gradient  de  pH  entre  les  deux  électrodes.  Les  protéines  déposées  migrent  vers  l’anode  ou  la cathode selon leur charge mais, au fur et à mesure de leur déplacement, le pH extérieur varie, ainsi  que  leur  propre  charge:  elles  ne  migrent  plus  quand  leur  charge  nette  est  nulle  (elles focalisent à l’endroit où le pH est égal à leur propre point isoélectrique (Figure 11). 

 Les ampholytes sont des mélanges d’un certains nombre de molécules de faible masse moléculaire, donc très mobiles, et comportant chacune plusieurs groupements acide carboxylique et amine

Plusieurs mélanges d’ampholytes ont été conçus pour réaliser des gradients de pH divers. Le choix d’un gradient donné dépend de l’expérience réalisée et but recherché. Dans le cas d’une analyse globale des protéines exprimées dans un système donné (tissu, cellules, etc.), le gradient choisi sera le plus large possible (3 à 10 par exemple). Il pourra être situé dans des gammes beaucoup plus étroites si l’intérêt porte sur une protéine particulière, dans l’intervalle  incluant le point isoélectrique de la protéine ciblée.

L’établissement   du gradient est effectué préalablement au dépôt de l’échantillon (pré-électrofocalisation), ce qui permet en générale une meilleure migration de celui-ci. L’IEF proprement dite intervient alors et provoque la migration de chaque protéine de l’échantillon jusqu’à son point isoélectrique où elle forme une bande étroite et stationnaire.

Pré-électrofocalisation et l’IEF se font à haut voltage (400 à 300 volts, pendant 15 à 20 heurs selon la longueur du gel.

L’IEF peut être effectuée dans des conditions dénaturantes (urée 4 à 9 M dans le gel, ce qui assure une meilleure solubilisation des protéines) ou non.

Le pouvoir de résolution de l’IEF est très bon : il permet de séparer les protéines d’un plasma sanguin en plus de 40 bandes (comparé à 15 bandes obtenues par électrophorèse de zone). 

Comme cette méthode utilise très peu d’ampholytes, elle est économique. Une expérience typique peut se faire dans un tube de 6 cm de long et de 5 mm de diamètre intérieur.

Les mélanges d’ampholytes sont de deux types : à gamme large, de 7 unités par exemple, pH 3-10 ou à gamme étroite pH 6-8 (2 unités pH seulement).

Figure 11 : Principe de l’isoélectrofocalisation

    Dans  l’IEF,  le  gel  de  polyacrylamide  doit  être  de  forte  porosité  pour  que  la  taille  des protéines n’influence pas leur migration.

  L’IEF  est  utilisée  pour  déterminer  le  point  isoélectrique  d’une  protéine  inconnue  par l’utilisation des marqueurs de point isoélectrique (standards), en traçant la droite d’étalonnage:

pHi   standards  =  f(Rf ).  Il  ya  une  relation  linéaire  entre  le  point  isoélectrique  des  protéines  et  leur rapport frontal (Figure 12).

Figure 12 : Mobilité des protéines en fonction de leur point isoélectrique.

(pnA: protéine A de pHi inconnu).

 3. ELECTROPHORSE BIDIMENSIONNELLE (EBD)

3.1. Principe :

Cette technique est fondée sur la séparation électrophorétique des protéines selon leur point isoélectrique et leur poids moléculaire au cours de deux migrations perpendiculaires successives (Figure13). La combinaison de ces deux critères indépendants  rend cette technique particulièrement résolutive.

L’isoélectrofocalisation  effectuée dans la première dimension consiste à séparer les protéines selon leurs points isoélectriques (voir l’isoélectrofocalisation). Elle est effectuée habituellement dans des gels cylindriques de polyacrylamide de petits diamètres (1 à 2 mm) à tension élevée 400 à 1000 V) pendant 15 à 20 heurs. Les polypeptides vont migrer dans un gradient de pH et se stabiliser à la position correspondant à leur point isoélectrique.

Figure 13 : Déroulement d’une électrophorèse bidimensionnelle.

Une fois la première dimension effectuée, le gel est déposé sur un gel en          «  plaque » de deuxième dimension. Ce gel contient un pourcentage de polyacrylamide supérieur à celui du gel de première dimension (ce qui permet d’augmenter l’effet de tamisage moléculaire). Il peut aussi contenir du sodium dodécyl sulfate (SDS) ce qui  permet de séparer les protéines de l’échantillon selon leur PM.

3.2. Réalisation pratique :  

II-1.  Préparation des échantillons est l’une des étapes les plus critiques pour obtenir une bonne résolution et une bonne reproductibilité en électrophorèse bidimensionnelle.

L’extraction des protéines permet d’obtenir  des polypeptides en solution, prêts à pénétrer dans le gel l’isoélectrofocalisation. Les protéines doivent être dénaturées. Les structures quaternaires sont éliminées afin de séparer les constituants des oligomères ; les structures tertiaires et secondaires soient accessibles au cours de l’électrophorèse. On doit aussi rechercher une solubilité maximale des polypeptides pour favoriser leur pénétration  dans le gel. Enfin, il faut évidemment veuiller à conserver  l’intégrité des polypeptides : éviter toute interaction avec d’autres molécules qui modifieraient leur pHi , les dégraderaient (protéases) , tendraient les faire précipiter (polyphénols) ou  à perturber l’électrophorèse (chlorophylle, lipides , acides nucléiques, sels en excès). L’élimination de composants indésirables et la concentration en protéines peuvent être réalisées par précipitation (TCA, acétone,…) et reprise des protéines dans un tampon en général très proche de celui utilisé pendant la migration.

Pour ces raisons, il existe plusieurs méthodes d’extraction selon qu’il s’agisse de protéines végétales ou animales, solubles (protéines du cytoplasme) ou insolubles (protéines membranaires, par exemple), stables ou instables, etc. 

3.2.1. Réalisation des gels :

Des diamètres de la 1.5 mm sont couramment utilisés pour des dépôts de l’ordre de 50 ug de protéines. Si la quantité de protéines est plus importante, il est préférable d’employer  des tubes de diamètre supérieur : par exemple, 3mm pour des dépôts de l’ordre du milligramme.

Le choix d’un gradient donné dépend de l’expérience réalisée et du but recherché. Dans le cas d’une analyse globale des protéines exprimées dans un système donné (tissu, cellules, etc.), le gradient choisi sera le plus large plus étroites si l’intérêt porte sur une protéine particulière, dans l’intervalle incluant le point isoélectrique de la protéine ciblée.

3.3. Focalisation :

L’établissement du gradient est effectué à faible voltage, préalablement au dépôt de l’échantillon (pré-électrofocalisation), ce qui permet en général  une meilleure migration de celui-ci et d’éliminer le persulfate d’ammonium en excès. Dans la pratique, cette étape est souvent inutile. L’électrofocalisation proprement dite intervient alors provoque la migration de chaque protéine de l’échantillon jusqu’à son point isoélectrique où elle forme une bande étroite et stationnaire.

L’électrofocalisation   se fait à haut voltage (400 à 300 volts, pendant 15 à 20 heurs selon la longueur du gel. Il est recommandé d’augmenter progressivement le voltage pendant la ou les premiers heurs de migration.

Les  protéines migrant d’autant moins vite qu’elles sont proches de leur pHi, on peut augmenter le voltage durant les derniers heurs de l’électrophorèse.

Les protéines peuvent avoir tendance à participer  dans le gel. En effet, plus elles s’approchent de leur pHi, moins elles sont solubles, Ceci eut avoir pour conséquence la formation de trainées en focalisation ou en deuxième dimension. Pour remédier à ce problème, on peut augmenter la concentration en ampholytes, connus pour augmenter la solubilité des protéines (par exemple, 4 %).L’électrofocalisation peut être effectuée dans des conditions dénaturantes (urée 8 M dans le gel, ce qui assure une meilleure solubilisation des protéines) ou non.

Il est préférable de contrôler la température durant le coulage des gels et la migration. Elle ne doit pas etre trop basse pour éviter la cristalisation des gels et des extraits saturés en urée. Elle peut etre ajustée entre 22 et 25°C.

3.4. L’équilibration :

Après migration, les gels d’IEF sont trempés dans un tampon d’équilibration qui permet de complexer les protéines avec le SDS et d’éliminer divers constituants de gel initial (urée, ampholytes, Triton X-100).

Le tampon doit avoir un pH de 6,8 s’il y a un gel de concentration dans la seconde dimension. Sinon, il peut être à pH supérieur (8,8). Il est préférable de limiter la durée de l’équilibrage, car une certaine quantité de protéines est nécessairement perdue au cours de cette étape. Cette équilibration est inutile dans le cas où les gels de première dimension sont suffisamment fins et si les protéines n’ont pas précipité.

3.5. La deuxième dimension :

Pour contrôler la migration, on utilise un témoin de migration, le bleu de bromophénol. Ce dernier peut être ajouté dans le tampon de la cuve supérieure ou dans le tampon d’équilibration, afin qu’il imbibe le gel de première dimension. La température de migration est en général ajustée entre 10 et 15 °C. La migration peut se dérouler à voltage constant, à ampérage constant ou mieux, à puissance constante.

Le gel de deuxième dimension peut comporter un gel de concentration superposé au gel de séparation. La fonction de ce gel – peu concentré en acrylamide et tamponné à pH 6,8 – est de regrouper les protéines sur une très faible épaisseur, avant l’entrée dans le gel de séparation.

La distance de migration est une fonction inverse du logarithme de la masse moléculaire. Pour éviter un tassement des spots de haute MM , il est possible d’utiliser le gel en gradient de concentration d’acrylamide de 10 à 15 % ou de 10 à 20% selon les cas. Cependant, il est assez difficile d’obtenir des gradients très reproductibles. Dans ce cas, on préférera utiliser un gel de séparation en concentration uniforme (couramment entre 10 et 15 %) d’acrylamide. Si l’on s’intéresse à une protéine particulière, il faut évidemment ajuster la concentration en fonction de sa MM supposée.

Le gel de première dimension est couché sur le haut du gel de deuxieème dimension et, si nécessaire, soudé à l’aide d’une solution d’agarose à 1% (quantité aussi limitée que possible) préparée dans le tampon de migration.

3.6. Révélation des protéines :

La détection des protéines séparées se fait par les méthodes habituelles comme pour un gel simple soit au bleu de Coomassie R-250 pour des protéines relativement abondantes (sensibilité 50 ng/tache), soit au nitrate d’argent (sensibilité de 1 ng/tache) ou encore par autoradiographie dans le cas d’un échantillon radioactif. La lecture de l’électrophorégramme se fait habituellement par densitomètre mais en raison du grand nombre de taches obtenues, on recourt au traitement informatique par comparaison avec des électrophorégrammes standards. L’analyse automatique représente un réel progrès par rapport au dépouillement visuel, en particulier pour l’analyse des variations quantitatives qui peuvent alors être traitées avec des outils statistiques appropriés : l’analyse de variance, par exemple, permettra de savoir si les variations observées sont significatives ou pas.

On peut aussi découper les taches, éluer les protéines, fabriquer des anticorps spécifiques ou séquencer.

Après révélation les gels peuvent être séchés (sécheur de gels en plaque), après imbibition dans du glycérol 5%. La face du gel non liée au support est recouverte de cellophane® ; c’est cette face qui est mise en contact avec la plaque de polyéthylène. En revanche, le Cellophane est à proscrire si le gel doit ensuite être autoradiographie.

L’acquisition des images en vue d’un traitement informatique doit être faite de préférence sur les gels avant séchage. Pour les autoradiographies, il est préférable d’utiliser un film à petits grains (haute sensibilité).

3.7. Applications :

L’électrophorèse bidimensionnelle peut être utilisée comme technique de purification, aboutissant à l’obtention de quantités faibles, mais utilisables, d’une protéine donnée. Ainsi, les spots visualisés après électrophorèse peuvent être découpés et utilisés, après élution de la protéine, pour la préparation d’anticorps spécifiques.

Une autre application plus remarquable encore a été développé récemment (Aebersold et Coll. 1987) et fait appel à l’électrotransfert sur membrane de nitrocellulose. La membrane est alors colorée de façon réversible (rouge Ponceau) et le spot correspondant à la protéine ciblée est découpé. Les protéines obtenus sont alors purifiées par HPLC et séquencés.

Le facteur limitant est le très grand nombre de tâches, pas toutes identifiées puisque sur un sérum normal on en détecte plus de 1000, pour analyser de tels résultats, l’utilisation de l’outil informatique s’avère nécessaire, car l’œil n’est pas capable de traiter des variations minimes d’intensité.

En raison de son pouvoir de résolution remarquablement amélioré, cette technique est utilisée pour réaliser des cartes peptidiques (ou empreintes peptidiques) caractéristiques de protéines des principaux tissus et organes dans l’espèce humaine. Un lecteur d’images programmé par ordinateur servira à l’interprétation des cas pathologiques, en les comparants par rapport à des cartes établies chez le sujet normal.

Les autres applications de cette technique son multiples : depuis la vérification de la pureté d’un échatillon (détection de fraudes) jusqu’à des études de variabilité génétique, en passant par le suivi des variations d’expression en fonction de différents facteurs : développement, différenciation, traitements (drogues, stress, hormones, etc.). la technique d’électrophorèse bidimensionnelle peut, par exemple, servir à comparer l’expression de protéines dans des conditions différentes. Il faut alors réaliser des électrophorèses correspondant à chacune des conditions à étudier.

4.     ELECTROPHORESE CAPILLAIRE (EC)

4.1. Principe :

L’électrophorèse capillaire est une variante de l’électrophorèse conventionnelle utilisant des tubes capillaire comme support de migration. La séparation des espèces moléculaires chargées est accomplie selon le même principe de l’électrophorèse sur gel conventionnel. Le principal avantage de cette technique est que le tube capillaire autorise une meilleure dissipation de la chaleur produite par le courant électrique. Par conséquent, de plus grands voltage peuvent être utilisés par rapport à ceux utilisés en électrophorèse conventionnelle. De ce fait, l’électrophorèse capillaire permet une meilleure résolution, une plus grande sensibilité ainsi que des temps de séparation beaucoup plus courts. La performance de cette technique est comparable à celle de CLHP, l’analyse conduit à un électrophirégramme ressemblant à un chromatogramme.

Il y a généralement un excès d’ions positifs à l’intérieur du capillaire, car la paroi est polyanionique, créant un flux entrainant toutes les espèces vers la cathode. Ce flux est appelé flux endo-osmotique. On peut remédier à ce problème en traitant la surface du capillaire. Les espèces migrent alors en fonction de leur charge. On peut aussi éviter le déplacement difficile de certaines espèces positives pouvant s’associer plus ou moins facilement à la paroi.

4.2. Mobilité électrophorétique et flux électrostatique  

    Dans ce paragraphe, nous allons voir comment la théorie, que nous avons brièvement développée dans la section consacrée à l'électrophorèse de zone, s'applique à l'électrophorèse capillaire. Les particules en suspension dans un liquide, de même que les molécules solvatées, peuvent porter une charge électrique résultante dont la grandeur et le signe dépendent de la nature du milieu et en particulier de son pH. Cette charge provient de la fixation, à leur surface, d'ions contenus dans le milieu tampon. Pour des ions de tailles comparables, les vitesses de migration sont plus grandes s'ils sont porteurs de charges plus importantes. Pour chaque ion, la vitesse de migration résulte de l'équilibre entre la force électrique FE qui s'exerce dans le champ E sur la particule de charge Q (F = QE), et les forces de frottement qui dépendent de la viscosité η du milieu. Pour les ions minéraux, les temps de migration dépendent de leur conductivité limite équivalente.

    En électrophorèse capillaire, on observe que les constituants d'un mélange se séparent dans le temps par effet de deux facteurs principaux appelés mobilité électrophorétique et flux électro-osmotique, qui sont définissables pour les ions, les molécule, les particules ou les micelles.

4.3. Mobilité électrophorétique                 

     La mobilité (ou migration) électrophorétique Ue correspond au déplacement des molécules chargées, dans un électrolyte supposé immobile, vers les électrodes de signe opposé. Ue correspond au quotient de la vitesse de migration de l'ion, ve, par la valeur du champ électrique, E. Ue= ve/E = ve.L/V, où L représente la longueur du capillaire et V la différence de potentiel appliquée à ses extrémités. U (cm².V^-1 .s^-1 ) s'obtient à partir d'une mesure expérimentale faite au départ d'un électrophorégramme. On affecte à la mobilité Ue le signe (+) ou (-) selon la nature de la charge portée; elle est nulle pour une espèce sans charge nette.

4.4. Flux électro-osmotique

        Le second paramètre qui contrôle le mouvement des solutés est appelé flux électro-osmotique Uos. Il est dû à l'écoulement de l'électrolyte par effet de la paroi interne du capillaire, qui est tapissée de groupements silanols qui se déprotonnent si le pH est supérieur à 2 pour former une couche polyanionique fixe. Les cations du milieu tampon, qui viennent recouvrir la paroi, se mettent en mouvement dès qu'un champ électrique est appliqué au capillaire. Les ions du tampon et les ions H⁺ (sous forme d'ions H₃O⁺) entraînent les molécules électrolytiques de l'échantillon. Ainsi, même un anion peut se déplacer vers l'électrode négative. Ce déplacement de l'électrolyte, produit par la charge des ions et le potentiel appliqué, peut être contrôlé en modifiant la tension, le pH ou en introduisant des additifs.

       On définit Uos par une relation calquée sur la précédente, v_os représentant la vitesse électro-osmotique des molécules neutres de la phase mobile : Uos = v_os/E = v_os.L/V.

Figure 14 :

Pour calculer Uos on doit déterminer v_os. Celle-ci est obtenue à partir du temps de parcours que met un marqueur neutre pour traverser le capillaire. On choisit une molécule organique, non polaire au pH de l'électrolyte utilisé et facilement détectable par absorption dans le proche UV, par exemple.

    Dans les appareils d'électrophorèse capillaire, on met à profit le flux électro-osmotique pour imposer à l'ensemble des espèces chargées de l'échantillon une même direction de migration dont le sens va de l'anode (+) vers la cathode (-). L'accroissement de vitesse du flux électro-osmotique vos diminue l'écart entre les temps d'arrivée des ions, allant dans le même sens, au niveau du détecteur.

    L'emploi de tubes capillaires en silice fondue, partiellement désactivés par un revêtement interne, permet de moduler le flux électro-osmotique. Ainsi, avec une paroi rendue hydrophobe, comme en CLHP, par un traitement avec un alkylsilyle, les protéines deviennent séparables, alors qu'elles ont tendance à rester accrochées à la paroi lorsque celle-ci n'est pas traitée. A la limite, on peut ne récupérer qu'une seule catégorie d'ions, en fonction de la direction du champ appliqué.

4.5. Mobilité apparente

       Le flux électro-osmotique, responsable d'une circulation de la phase mobile vers la cathode (-), est donc à prendre en compte pour évaluer la vitesse réelle de migration des molécules chargées. On observe que chaque ion a une vitesse apparente v_app facilement mesurable à partir de laquelle on définit une mobilité électrophorétique apparente Uapp telle que : Uapp= Uos+ Ue. En désignant par L, la longueur du capillaire, et par V la tension appliquée, le temps de migration t est donné par : 

   expression que l'on retrouve facilement à partir de Uapp = vapp.L/V et vapp = L/t.

         Pour simplifier la compréhension de ce phénomène, on pourrait assimiler la migration des molécules dans le capillaire à une course de natation dans une rivière dont le courant serait la transposition du flux électro-osmotique. Si les nageurs vont à leurs vitesses propres d'un point amont à un point aval, ils arriveront moins séparés dans le temps que s’ils remontent le courant de l'aval vers l'amont. Si le courant est moins rapide que la vitesse des nageurs, ils effectueront le même parcours, mais en mettant plus de temps. Enfin deux troncs d'arbres (transposition de molécules neutres) partis au même instant arriveront sans que soit modifiée la distance les séparant.

4.6. Instrumentation :

L’appareillage nécessaire pour ce type d’électrophorèse est constitué de deux réservoirs remplis de tampon, dans lequel plongent les extrémités de tubes capillaires en verre dont le diamètre interne varie de 15 à 150 µm et la longueur de 0,2 à 1 m. Dans ces solutions tampons sont également plongées les électrodes du courant électrique. La différence de potentiel appliquée, fournie par un générateur de haute tension, est de 20 à 30 kV, toutefois, l’intensité ne dépassant pas quelques dizaines de microampères, la chaleur dégagée par effet Joule est contrôlable grâce à la thermostatisation des capillaires disposés en casette. Sous l’effet du courant électrique, les composants de l’échantillon migrent vers l’électrode négative. Un petit volume d’échantillon (10 nl) est injecté à l’extrémité supérieure (positive) du capillaire et les composants séparés sont détectés à l’extrémité inférieure (négative) du capillaire. La détection est sembleble à celle utilisée en CLHP (absorbance, fluorescence, électrochimie, conductimètre, radiométrie et spectrométrie de masse). Les capillaires sont soit en silice fondue recouverte de polyimide, d’alcool polyvinylique ou, mieux, d’une couche transparente aux rayons UV, ce qui permet de réaliser des analyses spectrophotométrique « on-column » à partir de n’importe quel endroit du tube.

Le capillaire peut être rempli avec un gel (polyacrylamide ou agarose).

4.7. Électrophorèse en veine liquide ou en solution libre

      Procédé classique caractérisé par un capillaire rempli soit avec un tampon de pH acide (phosphate ou citrate) ou basique (borate), soit avec un ampholyte (molécule possédant une fonction acide et une fonction basique). Le flux électro-osmotique croît avec le pH de la phase liquide.

4.8. Électrophorèse capillaire sur gel

        C'est l'électrophorèse de zone actualisée. Le capillaire est rempli avec un électrolyte contenant un gel qui stabilise le milieu contre le phénomène de convection et limite la diffusion. La séparation résulte des effets conjoints de l'électrophorèse et de la chromatographie par perméation de gel. La résolution s'en trouve grandement améliorée.

4.9. Électrophorèse capillaire électrocinétique micellaire

      Cette variante, encore appelée chromatographie électrocinétique, s'avère utile pour les molécules qui ont tendance à migrer sans séparation. On ajoute dans la phase mobile un détergent cationique ou anionique, tel le SDS, pour former des micelles. Ces infimes gouttelettes, non miscibles à la solution dont la surface est polaire, emprisonnent les composés neutres plus ou moins efficacement par affinité du type hydrophile/hydrophobe.

Figure 15 :

4.10. Performances de l'électrophorèse capillaire

    Les électrophorégrammes, dont l'aspect est identique aux chromatogrammes, servent aussi à calculer les mêmes paramètres de séparation (facteurs de capacité, sélectivités, résolutions). L'efficacité peut être déterminée, soit graphiquement à partir d'un pic, soit à partir du coefficient de diffusion D du soluté :

L'efficacité peut atteindre 400 000 plateaux par mètre. La relation ci-dessus montre qu'elle croît avec la différence de potentiel appliquée et que les macromolécules, dont les facteurs de diffusion sont normalement plus petits que pour les petites molécules, conduisent à de meilleures séparations.

     La mise au point d'une séparation revient à trouver un milieu tampon adapté au problème à résoudre. L'électrophorèse capillaire est comparable à la chromatographie liquide quant aux performances. Elle complète utilement cette dernière pour les séparations de protéines, d'enzymes, de sucres et d'oligonucléotides. La sensibilité est très grande : on connaît des exemples de détection de quelques milliers de molécules vraies. La quantité requise d'échantillon est très faible et la consommation de réactifs ou de solvants est négligeable.

        Enfin, il est possible de réunir électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse en ligne, ce qui a donné un intérêt accru à cette méthode pour l'analyse des composés biologiques. L'effluent du capillaire est mélangé à un électrolyte d'appoint avant d'être nébulisé, ionisé et enfin introduit dans le spectromètre de masse.

4.11. Applications :

Le domaine d’application de cette technique recouvre aussi bien la séparation s’anions et cations inorganiques ou organiques que celle des molécules organiques ionisables tels que les acides aminés, acides organiques, oligonucléotides, fragments de restriction de l’ADN, etc…, des pesticides ainsi que de nombreuses autres substances intéressant les domaines de la pharmacie et des sciences de la vie. L’électrophorèse capillaire a fait l’objet de nombreuses applications dans le domaine de la séparation analytique des biopolymères (protéines, polysaccharides et ADN). Elle est normalement appliquée à la séparation rapide (moins de 20 minutes) de fragments d’ADN pouvant atteindre plusieurs kilobases.

5.     IMMUNO-ELECTROPHORESE

 Il s’agit d’une variante de l’électrophorèse qui utilise les propriétés qu’ont les complexes antigène-anticorps de donner in vitro des précipités. L’immuno-électrophorèse associe deux étapes successives : Dans un premier temps, le mélange protéique étudié, servant de mélange antigénique, est soumis à une électrophorèse sur une fine couche de gélose, à partir d’un petit puits de dépôts creusé à une des extrémités du gel. Lorsque l’électrophorèse est terminée, une solution d’anticorps (immuno-sérum) spécifique à la protéine recherche est placée dans une gouttière creusée parallèlement au sens de la migration.

 Les techniques ci dessous utilisent le fait qu'à des concentrations adéquates, du fait de la présence de familles d'anticorps (polyclonaux) et de la bivalence de ces anticorps, il se forme des agrégats (= réaction d'immunoprécipitation. Ce précipité est ensuite coloré selon les techniques classiques.

Il existe en fait tout un ensemble de techniques qui utilisent des anticorps associés à des séparations électrophorétiques. On peut distinguer les techniques suivantes :

5.1. Immuno-électrophorèse de Grabar et Williams

Les protéines migrent dans un gel d'agarose, puis on les révèle par une technique de double diffusion des antigènes et des anticorps, donnant des arcs de précipitation. Avec un antisérum total, on peut par exemple distinguer 30-40 protéines dans le sérum humain. On peut bien sûr l'utiliser également avec un antisérum spécifique (Figure 14).

Figure 14 : Immuno-électrophorèse de Grabar et Williams

5.2. Electro-immunodiffusion double (= électrosynérèse)

Cette méthode dérive en fait de la technique d'immunodiffusion double d'Ouchterlony. Elle consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique. Les conditions électrophorétiques sont choisies de façon à ce que les antigènes et les anticorps migrent en sens inverse (ceci est possible car le pHi des Immunoglobulines est supérieur à celui de beaucoup de protéines)( Figure 15).

Figure 15 : Electro-immunodiffusion double

5.3. Electro-immunodiffusion monodimensionnelle (Laurell)

Les protéines sont déposées sur des gels contenant l'antisérum. On se place à pH où les Ig migrent peu. Les protéines se déplacent et rencontrent les anticorps qui forment alors des précipités en forme de fusée appelés "rockets" dont la hauteur est proportionnelle à la concentration en protéine. On utilise une partie des puits pour faire un étalonnage (Figure 16).

Figure 16 : Electro-immunodiffusion monodimensionnelle

5.4. Electro-immunodiffusion bidimensionnelle (Laurell)

On sépare les protéines dans une première dimension en gel d'agarose. On coule ensuite un gel contenant l'immunsérum polyspécifique, puis on réalise la seconde dimension (Figure 17).

Figure 17 : Electro-immunodiffusion bidimensionnelle

6.     Techniques de transfert sur membranes

Hybridation moléculaire

 En recherche fondamentale, l’hybridation des acides nucléiques est souvent utilisée pour suivre à la trace les transcrits ARN et ainsi obtenir des informations sur la façon dont les gènes sont exprimés. Elle permet aussi d’identifier des relations entre des séquences ADN provenant de différentes origines. Par exemple, une séquence ADN de départ peut être utilisée pour identifier des séquences apparentées provenant de différents organismes ou d’individus différents de la même espèce, ou même des séquences apparentées du même génome que la séquence de départ. Souvent, l’hybridation des acides nucléiques est aussi utilisée en tant que moyen pour identifier des allèles porteurs de maladie ou des transcrits aberrants associés à une maladie.

 L’hybridation des acides nucléiques est un outil de base en génétique moléculaire. Elle repose sur la capacité des acides nucléiques simple brin, dont les séquences sont partiellement ou totalement complémentaires, à former une molécule bicaténaire (double brin) par appariements des bases les unes avec les autres (hybridation).

 6.1. Southern blot

 Le Southern blot est une technique mise au point par Edward M. Southern en 1975 pour rechercher des fragments de DNA sur une électrophorèse en les hybridant avec une sonde complémentaire.

1. Après avoir digéré le DNA par une enzyme de restriction, on obtient un mélange de très nombreux fragments de restriction. On soumet ces fragments à une électrophorèse pour les faire migrer dans un gel de haut en bas en fonction inverse de leur taille.
2. On fait un montage pour faire passer les fragments grâce à une montée de tampon imprégnant le gel puis une membrane de nylon où le DNA va se fixer par des liaisons stables.
3. La membrane de nylon avec le DNA fixé est alors mise à incuber dans un sac contenant une solution d’une sonde radioactive complémentaire du fragment de DNA qu’on recherche, à une température assez basse pour que l’hybride se forme mais assez élevée pour que cet hybride soit parfaitement complémentaire.
4. On lave la membrane des molécules de la sonde qui ne sont pas fixées à leur DNA complémentaire, puis on la met en présence d’un film radiographique vierge dans une enceinte opaque pour que la sonde radioactive fixée sur les fragments de DNA complémentaires impressionne le film.
5. On révèle le film où des taches noires (sur le négatif) correspondent aux emplacements où ont migré les fragments d’ADN complémentaires de la sonde. On compare les distances de migration avec des fragments de DNA radioactifs de tailles connues qui servent de marqueurs de taille.

6.2. Northern blot

Northern blot est une technique d’ARN blot qui a été développé  en 1977 à l’Université Stanford par Alwine, Kemp et Stark. Une méthode de laboratoire utilisée pour détecter des molécules d’ARN spécifiques au sein d’un mélange d’ARN. Northern blot peut être utilisé pour analyser un échantillon d’ARN à partir d’un tissu ou un type particulier de cellule afin de mesurer l’expression de gènes d’ARN spécifiques.

 La recherche en biologie moléculaire : l’étude directe de l’expression des gènes au niveau de l’ARNm détection de la taille de transcription ARNm étudier la dégradation des ARN étudier épissage de l’ARN peut détecter des transcrits d’épissage alternatif étude la demi-vie de ARN IRES étude (site d’entrée interne des ribosomes) Pour supprimer la possibilité de la digestion d’ARN souvent utilisé pour confirmer et de vérifier transgéniques.

 Séparation des ARN sur gel par électrophorèse. Transfert des ARN sur membrane (capillarité). Hybridation de la membrane avec une sonde spécifique du gène d’intérêt

Isolation d’ARN (total ou de poly (A) ARNm) Génération de sonde Électrophorèse sur gel dénaturant d’agarose Transfert à un support solide et l’immobilisation Pré- hybridation et l’hybridation avec la sonde Lavage Détection

6.2.1. Avantages :Ø La détection de la taille d’ARN.Ø L’observation des produits d’épissage alternatifs d’ARN.Ø L’utilisation de sondes ayant une homologie partielle.Ø La qualité et la quantité d’ARN peut être mesurée sur le gel avant buvard, et les membranes peuvent être stockées et sondé pendant des années après buvard.Ø L’expression des marqueurs tumoraux spécifique par hybridation ARN –ADN.

6.2.2. Inconvénients:

Ø La dégradation de l’échantillon par ARNases qui peuvent être évitées par une bonne stérilisation de la verrerie et l’utilisation des inhibiteurs de RNase comme DEPC( diéthylpyrocarbonate).Ø Les produits chimiques utilisé dans la plupart des taches du Northern peut être un risque pour le chercheur, comme le formaldéhyde, les matières radioactives, le bromure déthidium, DEPC, et la lumière UV sont tous nuisibles dans certaines expositions.

Northern blot, même si une technique relativement ancienne est encore aujourd’hui utile dans l’étude et l’analyse de l’ARN. Cette situation est attribuable à sa flexibilité, simplicité. Il exige essentiellement que l’ARN extrait est soumis à un gel d’électrophorèse, qui est ensuite blotter à une membrane solide, puis hybridé avec la sonde appropriée qui aide à l’identification et l’analyse de la molécule d’ARN. La technique s’est avérée utile et indispensable dans l’étude et l’analyse de molécules d’ARN dans les cellules de la vie d’organismes.

 6.3. Test de Western blot (immunotransfert) 

On utilise des anticorps pour détecter des protéines cibles sur le Western blot (immunotransfert).Les anticorps sont conjugués à des marqueurs fluorescents ou radioactifs ou encore à des enzymes pour provoquer une réaction suite à l'ajout d'un réactif, entraînant une coloration ou une émission de lumière qui favorise la détection.

Le terme Western blotting s'appuie sur un jeu de mots. Le transfert de Southern, qui est une méthode de détection de séquences ADN spécifiques. Le Western blot (immunotransfert), de même que le transfert de Northern (pour la détection d'ARN), joue sur la signification de ce nom.

Différents types d'électrophorèse de protéines sur gel peuvent être employés, en fonction des critères de séparation des protéines. Les méthodes d'électrophorèse communément utilisées sont : SDS-PAGE, native-PAGE et la focalisation isoélectrique.

6.3.1. Transfert

Une fois le mélange de protéines séparé, les bandes de polypeptides sont transférées vers une membrane porteuse. Pour ce faire, la membrane est fixée au gel et ce « sandwich » est transféré vers une chambre d'électrophorèse. Il est possible qu'une partie du SDS soit lavée, et que la protéine soit en partie renaturée, c'est-à-dire qu'elle regagne sa structure bidimensionnelle et tridimensionnelle. Cependant, la charge électrique appliquée entraîne la migration verticale des protéines en dehors du gel, dans le même sens que celui emprunté lors de leur migration dans le gel, pour finir sur la membrane. Les bandes de protéines sont alors liées à la membrane. Les bandes « transférées » peuvent désormais être utilisées à d'autres fins (par ex., pour la détection de protéines spécifiques avec des anticorps spécifiques).

6.3.2. Immunodétection

Il est possible d'identifier des anticorps spécifiques une fois les protéines séparées et transférées. Les anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) spécifiques se lient à « leur » bande de protéines. Les anticorps sans liaison spécifique sont éliminés par lavage à l'aide de tampons contenant un détergent. De plus, des poches de liaisons non spécifiques peuvent se retrouvées bloquées avant que des anticorps spécifiques ne soient ajoutés.

Les anticorps primaires sont généralement appliqués en premier, avant d'être reconnus par un anticorps secondaire. L'anticorps secondaire est conjugué à de la couleur, de la radioactivité ou une enzyme aux fins de la détection. Des anticorps conjugués à de la biotine sont également utilisés à cette fin.

Il peut parfois être utile d'utiliser des anticorps primaires polyclonaux car ces anticorps reconnaissent divers épitopes, contrairement aux anticorps monoclonaux dont l'affinité de liaison est limitée. Suite à l'immunodétection, il est possible d'éliminer l'anticorps de la membrane pour une analyse approfondie avec d'autres anticorps (par ex., pour détecter d'autres anticorps spécifiques dans le mélange protéique soumis à analyse).

L'analyse du Western blot est ensuite réalisée à l'aide d'un éventail de systèmes d'imagerie différents (par ex., luminescence, réaction colorante, autoradiographique).
 6.3.3. Réalisation un Western blot

La méthode du Western blot (immunotransfert) offre toute une gamme d'avantages par comparaison à d'autres dosages d'immuno-absorption tels que le dosage ELISA.

Le Western blot (immunotransfert) dépasse le concept du test ELISA en permettant la séparation du mélange protéique par taille, charge et/ou conformation. La méthode d'élimination décrite permet de détecter plusieurs cibles, contrairement au test ELISA qui permet de ne détecter qu'une seule protéine. Étant donné que l'électrophorèse de protéines sur gel sépare les protéines en bandes, il est possible de déterminer la taille de la protéine/du polypeptide cible. Il est également possible de (semi-)quantifier la protéine d'intérêt en exécutant en parallèle une analyse interne de quantité sur les échantillons dans le gel. De la même manière, la teneur en protéines des échantillons peut être comparée (« échantillon A comporte plus de protéines que l'échantillon B »).

Un des inconvénients du Western blot (immunotransfert) réside dans le fait qu'il est coûteux en temps (par rapport au test ELISA) et exige de l'expérimentateur une solide expérience. En outre, il requiert une optimisation des conditions expérimentales (par ex., isolation des protéines, tampons, type de séparation, concentration de gel, etc.).

Il existe de nombreux types différents et de nombreuses méthodes différentes de Western blot (immunotransfert). C'est pourquoi il couvre de nombreux sujets et de nombreuses applications.