1. ELECTROPHORESE DE ZONE

1.1. Historique :

  L’origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se sont  inspirés  des  études  de  Hermann  Von  Helmholtz  menées  sur  l’électro-osmose.  Celui-ci constate qu’il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe opposé à leur charge.

  En  1937,  Ame  Wilhelm  Kaurin  Tiselius,  met  au  point  la  première  électrophorèse: l’électrophorèse libre. Cette technique lui a permis de séparer les protéines du sérum sanguin en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée  afin de  réaliser  des  mesures  optiques  au  travers  du  tube.  Il  a  pu  obtenir  sur  le  pôle  positif  des protéines de charge très négative comme l’albumine et sur le pôle négatif des protéines de charge plus positive comme les globulines.

  En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant la technique d’électrophorèse sur papier.

 En  1952,  Pierre  Grabar  élabore,  en  collaboration  avec  C.A.  Williams,  une  méthode d’analyse  immuno-électrophorétique,  qui  permet  d’analyser  des  mélanges  très  complexes d’antigènes. Dès la première application de cette méthode à l’analyse du sérum sanguin humain, il   parvient   à   déceler   dans   le   sérum   plus   de   30   constituants   indépendants,   alors   que l’électrophorèse  en  veine  liquide  ou  sur  papier    ne  permettait  d’isoler  que  5  ou  6  groupes  de protéines. 

 En 1955, O. Smithies met au point l’électrophorèse en gel d’amidon.  En  1957,  Joachim  Kohn  sépare  les  phénotypes  de  l’hémoglobine  en  élaborant  la technique d’électrophorèse sur membrane d’acétate de cellulose. 

 En 1969, Beber et Osbom introduisent l’agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les différentes sous-unités protéiques.      

 1.2. Principes généraux :

            A l’origine, l’électrophorèse était une technique de séparation des molécules ionisées sur la base de différences de leurs charges électriques. Ses améliorations ont été telles qu’actuellement elle peut séparer les molécules toujours selon leurs charges électriques mais aussi selon leurs tailles ; ce dernier critère étant parfois le seul.

            Le principe de l’électrophorèse est le suivant: considérons la solution à analyser, formée de molécules électriquement neutres, d’anions (-) et de cations (+). On dépose cette solution sur un support conducteur aux deux extrémités desquelles une tension est imposée. En chaque point du support existe donc un champ électrique E. sur chaque molécule de charge q, une force F va s’exercer telle que :

F = q.E

            Cette force va provoquer le déplacement des molécules chargées à une vitesse v sur le rapport. v sera proportionnelle notamment à q et à E. on a alors la relation suivante :

v= q.E / 6π η r

            Avec    η = viscosité du support conducteur où se déplacent les molécules,

r = taille de la molécule

            On écrit en général :

v = m . E et m = q/ 6π η r

            m. mobilité électrophorétique de la molécule, est en fait le critère selon lequel deux molécules seront séparées ou non.

            Au terme de la séparation, on obtient :

            - les anions se sont séparés les uns des autres en fonction de leurs différentes mobilités électrophorétique, en migrant vers la cathode.

            - les molécules neutres sont restées groupées au point de dépôt.

            - les cations se sont séparés les uns des autres, en fonction de leurs mobilités électrophorétiques, en allant vers l’anode.

1.3. Les supports :

            Dans sa réalisation pratique, l’électrophorèse est proche de la chromatographie sur couche mince. (Figure 01)

            Elle se réalise sur un support plan imbibé d’une solution aqueuse conductrice. La tension est imposée entre les deux bords opposés du support.

            Le support solide du liquide conducteur peut être totalement inerte chimiquement : c’est le cas du papier ou mieux de l’acétate de cellulose. Ce dernier est le support le plus utilisé pour la séparation des protéines sériques en routine.

Figure 01 : Dispositif expérimental utilisé en électrophorèse.

D’autres supports se comportent en fait comme des tamis moléculaires: c’est le cas des gels d’amidon ou de polyacrylamide. Ces gels forment des réseaux qui ralentissent le déplacement des grosses molécules. Sur ce type de gel, la séparation se fait donc à la fois selon la charge et selon la masse des molécules.

1.3.1. L’acétate de cellulose :

            C’est le support le plus adapté au travail de routine dans les laboratoires de biologie. Quelques microlitres de la solution à étudier (extrait enzymatique, protéines sériques, lipoprotéines, etc.) sont déposés sur la surface, imbibée de tampon, de la  feuille d’acétate de cellulose sous forme d’une fine ligne à l’aide d’un applicateur spécial. A l’échantillon, est ajoutée une molécule colorée (indicateur de front) dont les propriétés sont choisie pour être celle qui migrera le plus rapidement dans le mélange, ceci afin de suivre la migration des autres molécules qui sont en général invisibles à ce stade. Après migration (30mn à 230 volts) et coloration, le support est séché puis rendu transparent (trasparisation) ce qui facilite considérablement la lecture densitométriques directes des résultats. Les différentes fractions séparées sont révélées par des colorants spécifiques, qui permettent de les caractériser. Chaque molécule apparait comme une bande fine, perpendiculaire au trajet de migration et dont l’intensité dépend de sa concentration. Les enzymes peuvent être révélés en utilisant leurs activités spécifiques sur des substrats convenablement choisis. Le sérum humain est résolu en six fractions : albumine, α1, α2, β1, β2 et γ globuline (Figure 02).

Figure 02 : Electrophorèse des protéines sériques sur acétates de cellulose

 1.3. 2. Le gel de polyacrylamide :

Un gel de polyacrylamide est obtenu grâce a la polymérisation de deux substances chimiques : le monomère d’acrylamide  de formule CH₂ =CH—CO—NH₂ et son co-monomère, le bis-acrylamide de formule CH₂ =CH—CO—NH--CH₂—NH—CO—CH=CH₂, en présence d’un catalyseur. La polymérisation des solutions d’acrylamide peut être effectuée soit chimiquement en présence de persulfate d’ammonium, soit photochimiquement  en présence de riboflavine.

            L’ouverture des doubles liaisons des monomères conduit a la formation de longs polymères. Les chaines ainsi obtenues sont reliées entre elles par le bis-acrylamide qui établit des ponts entre ces chaines (Figure 03).

            Les gels sont définis par deux valeurs : le lettre T désigne la quantité totale d’acrylamide et de bis-acrylamide pour 100 ml de solution et la lettre C désigne la proportion relative de bis-acrylamide par rapport a la valeur T précédemment définie.

            En résumé : T = acrylamide + bis-acrylamide pour 100ml de solution et C = bis-acrylamide/ T pour 100 ml de solution.

Figure 03 : Structure du gel de polyacrylamide.

            Par sa porosité plus ou moins grande, le gel exerce sur les protéines qui le traversent un effet de filtration d’autant plus important que la valeur T est élevée. On put ainsi, suivant les conditions choisies, séparer des substances de poids moléculaires très divers.

            Deux modalités sont utilisées :

            1. Gel coulé en tube de verre de 5 à 10 cm de long sur 0,5 à 0,8 mm de diamètre, dressé verticalement pendant la migration (Figure 05 ) ; il faut un tube par échantillon.

            2. Gel coulé entre deux plaques de verre (Figure 05), se prêtant à une exploitation plus souple en permettant une comparaison plus facile entre échantillons, car les conditions électrophorétiques sont strictement identiques pour tous les échantillons. La taille des plaques varie de 8 à 15 cm en largeur sur 8 à 20 cm de hauteur. Les gels utilisés pour le séquençage des acides nucléiques sont beaucoup plus longs (jusqu’à 30 à 40 cm) que ceux utilisés pour la séparation des protéines. L’épaisseur du gel est réglée par des espaceurs insérés entre les deux plaques de verre. Les gels les plus couramment utilisés ont entre 0,75 et 2,5 mm d’épaisseur. Il existe aussi des systèmes permettant de préparer des gels ultra-fins de 0,1 à 1,0 mm. Les puits de dépôts sont réalisés à l’aide d’un « peigne » en plastique inséré entre les deux plaques de verre durant la polymérisation. On trouve également dans le commerce des plaques de gel prêtes à l’emploi.

            Pour une bonne résolution, le volume des dépôts est limité, de 1à 20 µl en général. La quantité de protéines déposée dépend de l’épaisseur du gel, inférieure en général à 100 µg par puits pour les gels ordinaires. Les gels ultra-fins offrent les avantages de temps réduit de migration, de meilleure résolution, de procédures accélérées de révélation, et de charges d’échantillons réduites.

            Il existe deux types de gels, soit des gels dont la concentration est constante (ex : 5; 10 ou 15%) soit des gels dont la concentration varie d’une manière continue d’une extrémité a l’autre ou gradients de polyacrylamide ( ex : 3 a 30 % )

            Suivant le type de système électrophorétique mis en jeu, on distingue les systèmes monophasiques (ou continus) dans lesquels la composition du tampon est identique au niveau de l’anode, de la cathode et du gel et des systèmes multiphasiques (ou discontinus) dans lesquels les tampons différent les uns des autres. Les systèmes monophasiques sont employés lorsqu’une résolution suffisante est obtenue par le seul effet de la filtration des protéines dans le gel (cas des gradients de polyacrylamide). Les systèmes multiphasiques, plus complexes, sont habituellement utilisés lors de l’électrophorèse dans des gels de concentration constante.

            Il est possible aussi de superposer en couches successives des gels qui diffèrent non seulement par leur concentration en polyacrylamide (et donc par leur porosité) mais aussi par la composition des tampons qui y sont inclus (Figure 04).

Figure 04: Principe de l’électrophorèse discontinue.

            Lors du passage du courant, le mélange de protéines migre du gel le plus poreux, appelé gel de concentration (stacking gel) où se fait la concentration des protéines vers le gel inférieur, moins poreux, ou gel de séparation non seulement selon leurs charges électriques mais aussi selon leurs tailles moléculaires en raison de l’effet de filtration exercé par le gel polyacrylamide. Chaque espèce de protéine se concentre ainsi dans une zone étroite en bandes minces ce qui permet d’obtenir une très grande résolution plus élevée que celle obtenue avec un tampon continu. Cette forme d’électrophorèse de zone est appelée l’électrophorèse discontinue parce qu’un tampon discontinu est employé et parce que les zones protéiques apparaissent sous forme discoïdes (en terminologie anglo-saxone, disc électrophoresis).

            L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide est rapide, précise, reproductible, sensible. Un sérum humain est résolu en au moins une vingtaine de fractions. Le gel est transparent se qui permet une évaluation densitométrique aisée.

            Dans un gel de polyacrylamide, la séparation des protéines peut être réalisée en fonction du seul critère de masse moléculaire.

Figure 05 : Cuve pour électrophorèse verticale en plaques (1) ou en tubes (2)

1.3. 3. Le gel d’agarose :

            Le gel d’agarose est formé de longues chaines où alternent les deux monomères suivants (Figure 06).

Figure 06: Structure d’une portion de chaine d’agarose.

            Ces chaines sont liées par des ponts hydrogène et non par des ponts covalents comme dans le cas des autres gels.

            Le gel est constitué à l’aide d’une solution d’agarose dans un tampon déterminé. On la coule à chaud sur une lame de verre où elle se solidifie par refroidissement. En choisissant plusieurs concentrations d’agarose. On prépare des gels à différentes dimensions de pores : les gels faiblement concentrés à larges pores servent de support aux plaques destinées à l’immuno-électrodiffusion ou à l’immuno-électrophorèse.

1.3. 4. Le gel d’amidon :

            Dans l’électrophorèse en gel d’amidon, la structure même du gel intervient comme un filtre en ralentissant la progression des molécules les plus volumineuses. A partir d’amidon partiellement hydrolysé, en suspension homogène dans un tampon approprié (13 à 15g pour 100 ml), on obtient par chauffage un gel qui, porté à l’ébullition, revient à l’état liquide. Celui-ci, coulé dans un bac de plexiglas. Se prend en gel par refroidissement, donnant ainsi le milieu filtrant approprié. Les protéines à séparer sont déposées dans une fente pratiquée dans le gel. Après électrophorèse, le gel est coupé dans son épaisseur et les protéines révélées par des colorants habituels.

            Le sérum humain est résolu en près d’une vingtaine de bandes. L’opération complète demande au minimum quinze heures.

1.4. Facteurs affectant la vitesse de migration des molécules :

1.4.1. Charge des molécules :

            Seules les molécules ionisées ou ionisables sont séparables par électrophorèse : cas des acides aminés, des nucléotides et de leurs polymères notamment. L’état d’ionisation dépend souvent du PH de la solution aqueuse qui imprègne le support.

            Exemple : cas des protéines, molécules amphotères (Figure 07    ).

Figure 07 : ionisation d’une molécule amphotère en fonction du pH du milieu.

            - Si le pH est supérieur à leur pHi, elles sont chargées négativement est migrent vers l’anode.

            - Si le pH est égal à leur pHi, leur charge nette est nulle, elles ne migrent pas.

            - Si le pH est inférieur à leur pHi, elles sont chargées positivement et migrent vers la cathode.

            Pour avoir des pH bien contrôlés, on utilise en général des solutions tampons pour imprégner le support. Le pH du tampon utilisé sera fonction des pHi des protéines que l’on désire séparer. Pour une tension donnée, les fractions protéiques tendent à se déplacer vers l’anode vers une vitesse d’autant plus grande que le pH de la solution est plus  alcalin par rapport à leur pHi. L’accroissement de ce facteur s’accompagne d’une augmentation de la qualité de la séparation. Pour la séparation des protéines sériques, on utilise généralement un tampon à pH 8,6 auquel la plupart des protéines sont fortement anioniques.

1.4. 2. Tension du champ :

            Quand la tension est augmentée, la vitesse de migration augmente aussi. Cependant pour des tensions trop fortes, on risque un échauffement (effet Joule) qui peut dessécher le rapport ou dénaturer les protéines. On refroidit souvent celui-ci par un circuit d’eau froide. Pour une puissance P du générateur de tension, la tension V va être liée à la résistance R du support par la formule P= V² / R. Quand  la résistance du support est forte, c'est-à-dire quand la solution conductrice à une faible force ionique, alors on peut appliquer, une tension relativement forte. En pratique, les tensions utilisées sont comprises entre 100 et 200 volts.

            En électrophorèse de zone, il est nécessaire de pouvoir appliquer durant toute la durée de l’expérience, un champ électrique homogène. En effet, la vitesse de migration d’une molécule ionisable n’est constante que si le champ électrique a une intensité constante. Cette intensité I est fonction de la différence de potentiel V et de la résistance du support R selon la loi d’Ohm : I = V /R pour les gels d’acrylamide, les intensités utilisées sont de l’ordre de 5 à 10mA/ gel.

            Les générateurs de courant fonctionnent à tension constante, intensité constante ou puissance constante. Dans le cas où la résistance du système ne varie pas beaucoup, on opère à voltage constant comme dans le cas des gels électrophorétiques  classiques (gel de polyacrylamide ou d’agarose pour électrophorèse de protéines ou d’acides nucléiques). Mais en général, la résistance s’accroit du fait de la mobilité des ions durant la migration ; si l’intensité du courant est maintenue constante, la puissance augmente, provoquant un échauffement du gel. Selon les conditions de l’expérience, un compromis entre la vitesse de migration et l’échauffement doit être établi afin d’obtenir, d’une part des vitesses de migration les plus grandes possibles pour éviter des problèmes de diffusion latérale, qui conduisent à l’élargissement des taches ou des bandes et, d’autre part, d’éviter l’échauffement excessif qui risque de détériorer le gel et affecter la stabilité des substances séparées.

1.4.3. Taille des molécules :

            La mobilité électrophorétique diminue quand la taille des molécules augmente. Cet effet est cependant beaucoup amplifié sur les gels d’amidon est de polyacrylamide surtout (tamis moléculaires). Le comportement observé est alors l’inverse de celui de la chromatographie d’exclusion : les grosses molécules pénètrent dans les pores du réseau mais y sont ralenties et prennent du retard sur les petites molécules. Dans le gel de polyacrylamide, la taille des pores du gel dépend de la concentration du polyacrylamide : plus cette concentration est élevée, plus les pores sont petits et plus les protéines de grande taille auront du mal à les traverser. En jouant sur la porosité des gels, sur la durée d’électrophorèse et sur l’intensité du champ électrique, on peut localiser le pouvoir de séparation le plus élevé dans une zone de poids moléculaires déterminés.

1.4.4. Viscosité de la solution :

            Les solutions qui imprègnent les supports d’électrophorèse sont parfois visqueuses car assez concentrées. Les vitesses de migration sont donc relativement faibles à ce point de vue. Par exemple, pour les protéines, la solution conductrice peut parfois contenir 0,8 M d’urée pour détruire les liaisons hydrogènes entre les sous-unités que l’on veut séparer.

            Une force ionique de 0,1 est généralement appropriée. Une forte concentration ionique présenterait l’inconvénient d’un échauffement trop important. Une concentration plus faible diminuerait exagérément le pouvoir tampon de la solution.

1.5. Applications de l’électrophorèse :

            Bien qu’elle puisse s’appliquer à tous les corps ionisables, l’électrophorèse reste surtout appliquée à l’analyse des protides et, plus spécialement, des protéines et aussi les acides nucléiques.

1.5. 1. Acides aminés :

            On réalise souvent des électrophorèses à deux dimensions pour analyser des mélanges d’acides aminés. L’identification des acides aminés se fait en faisant subir l’électrophorèse à des solutions standards d’acides aminés.

1.5.2. Protéines :

            Des électrophorèses simples ou doubles permettent de séparer entre elles les protéines d’un mélange complexe qui ne contient au départ que des protéines. Selon le support, on réalise :

            - séparation selon la charge (sur acétate de cellulose). Le choix du pH est important.

            - séparation selon la charge et la masse (sur gel d’amidon ou de polyacrylamide), en conditions non dénaturantes.

            - séparation seulement selon la masse, en conditions dénaturantes.

1.5.2.1. Electrophorèse en conditions dénaturantes :

            C’est l’une des variantes les plus répandue de l’électrophorèse, utilisée pour séparer les protéines en fonction de leurs poids moléculaire.

            Dans le cas des protéines globulaires, un traitement préalable des protéines par un détergent anionique, le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate C₁₂H₂₅SO₄, Na⁺) (Figure     ) est nécessaire, en présence de SDS, les protéines oligométriques sont dénaturées en monomères uniformément chargés négativement.

            L’échantillon doit être pré-incubé à chaud en présence de SDS. Environ, 1,4 de SDS sont adsorbés par g protéines. Ce détergent anionique dissocie les structures quartenaires des protéines  oligométriques et chaque monomère se ramasse sur lui-même en sphère. Il a une partie hydrophobe chargée positivement qui va se fixer sur la protéine et une partie saline chargée négativement à son extrémité en contact avec le milieu.

            Si on ajoute du 2-mercapto-éthanol (Figure 08) ou du dithiothéréitol à ce milieu d’incubation, on réduit les liaisons disulfures intermonomériques et on peut ainsi trouver le nombre de chaines polypeptidiques composant la protéine.

            Ainsi, tous les monomères se trouvent sous forme de complexes SDS protéines ayant la même charge nette (négative) et ne sont plu séparés dans le gel qu’en fonction de leur taille, c'est-à-dire de leur PM. Pour déterminer le PM d’une protéine, il suffit de réaliser un étalonnage au moyen d’une gamme de protéines standards de poids moléculaires connus. Il faut, évidemment, tenir compte de ce qu’un polymère sera décomposé en sous-unités. C’est donc le PM des sous-unités qu’on mesure combinée à une détermination de PM par tamisage moléculaire, cette méthode permet généralement de trouver le nombre de sous-unités qui composent un polymère donné. Ainsi, si par tamisage moléculaire on a un poids moléculaire de 100 et sur gel dénaturant un poids de 50, on en conclue que la protéine est constituée de deux sous-unités identiques.

Figure 08: Le sodium Dodecyl Sulfate ou SDS (à gauche), détergent anionique, et le mercaptoéthanol (à droite), agent réducteur, sont deux substances chimiques utilisées pour solubiliser les protéines pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS.

Ce type d’électrophorèse peut se faire sur gels cylindriques ou plats (Figure 08).

1.5. 2 .2 .1. Détermination du PM  des protéines par électrophorèse dans un gel à concentration constante

            Lors de l’électrophorèse dans un gel à concentration constante et après traitement des protéines par le SDS, il existe une relation directe entre le PM et la mobilité d’une protéine. Les protéines migrent en fonction inverse de leur PM. Lorsqu’on porte le logarithme du PM en fonction de la mobilité, on obtient une droite de pente négative. (Figure 09).

            Dans le cas d’un gel en plaque où tous les échantillons sont soumis aux mêmes conditions électrophorétiques, on peut, plus simplement, exprimer la distance parcourue en fonction du logarithme du PM. Cette relation n’est linéaire, pour une valeur donnée de T, que dans une gamme relativement étroite de PM (par exemple, 20- 50 000 quand T = 7%).

Figure 09: séparation des protéines sur un gel en plaque, en condition dénaturante.

1.5. 2. 2. 2. Détermination du PM des protéines par électrophorèse dans un gradient linéaire de polyacrylamide

            Dans les gels où la concentration en polyacrylamide varie régulièrement (gradient). L’effet de filtration exercé par les mailles du réseau de polyacrylamide va en s’accroissant au fur et à mesure de la progression des protéines sont séparées suivant leur taille moléculaire et leur charge électrique, mais l’effet de filtration est ici prépondérant. Une fine résolution est obtenue par le seul effet du tamisage moléculaire.

            Lorsque des protéines traitées par le SDS sont soumises à une électrophorèse prolongée dans un gradient de polyacrylamide, il existe une relation linéaire entre le logarithme du PM et le logarithme de la concentration en polyacrylamide atteinte par ces protéines après électrophorèse.

Figure 10: Courbe d’étalonnage utilisée pour la détermination des poids moléculaires de protéines

            On mesure la distance parcourue par chaque protéine ainsi que la longueur totale du gel. A une distance donnée de migration de la protéine correspond à une concentration T de polyacrylamide. Cette valeur peut être aisément calculée en raison de l’accroissement linéaire du gradient.

            Dans des gels en gradient linéaire de 3 à 30%, cette relation est utilisable avec une grande précision pour des protéines de PM compris entre 12 000 et 1 000 000. La courbe de référence doit être établie avec 7 à 8 protéines dont les PM s’échelonnent régulièrement entre ces deux limites. Pour une protéine inconnue, la détermination de T permet de calculer son PM.

            La fiabilité de la méthode dépond largement de la qualité du gradient de polyacrylamide d’où l’importance de respecter un protocole précis pour l’obtention des gels. La précision varie légèrement en fonction de la concentration en bis-acrylamide ©. Quand C= 8,4% elle est de + ou – 5% quand C = 3,8% elle est de + ou – 7%.

            La précision est du même ordre  avec des protéines réduites. Cependant, si on désire mesurer avec précision le PM d’une protéine réduite, tous les témoins devront être également réduits en présence du 2-mercaptoethanol. Dans ce cas, rappelons qu’après réduction, une protéine pluricaténaire est dissociée en plusieurs chaines.

            Enfin, cette méthode utilisant un gradient de polyacrylamide s’applique avec une précision similaire aux glycoprotéines et aux holoprotéines, alors que les gels de concentration constante donnent des erreurs importantes avec les glycoprotéines.

1.5. 3. Acides nucléiques :

            Les acides nucléiques sont toujours négatifs à tout pH utilisé en électrophorèse et, de plus, portent une charge négative fixe par nucléotide, par leur groupement PO₄. La séparation électrophorétique des acides nucléiques se fait donc strictement d’après leur taille.

1.6. Méthodes de défection des protéines et des enzymes après migration :

            Aussitôt après une séparation électrophorétique, les zones protéiques peuvent être repérées in-situ, de façon spécifique, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une élution. Le gel doit toutefois être préalablement fixé en le mettant dans une solution permettant l’immobilisation des protéines dans le gel, soit par des solvants organiques (méthanol), soit par des acides (acide acétique).

            Le gel de polyacrylamide présente un avantage considérable car il est transparent. Par contre l’amidon qui, lui est opalescent, peut être coupé en tranches très facilement, il est possible alors de procéder à plusieurs révélations après une migration.

1.6.1. Colorations générales des protéines :

            Les différents colorants, leurs propriétés et leurs principales applications sont données dans le tableau :

·         Le noir amide : c’est un des premiers colorants utilisés pour la mise en évidence des protéines dans les gels, relativement peu sensible ;

·         Le bleu de Coomassie : technique très répondue. Il en existe de nombreux protocoles. Il est nécessaire de décolorer le gel afin d’éliminer le « bruit de fond ». le colorant se fixe sur les protéines au niveau de la liaison peptidique. Sa sensibilité est variable selon le protocole employé, de 1 à 10 µg.

·         Nitrate d’argent : technique plus sensible que les précédentes, de 10 à 100 ng, mais plus délicate.

L’appréciation de l’intensité des bandes ou des taches peut se faire soit visuellement, soit avec un densitomètre intégrateur, comme le montre la figure (Fig.    ).

Sur les gels plats, on peut réaliser l’électrophorèse de nombreux échantillons dans des conditions identiques, ce qui permet une excellente comparaison de la composition d’une série d’échantillons.

1.6 .2. Colorations spécifiques :

      ==> Par une réaction enzymique :

      Les enzymes sont des protéines capables de catalyser une réaction chimique. Il peut être possible de localiser la protéine après sa migration en mettant en évidence une modification du milieu liée à la réaction catalysée, apparition ou disparition d’un produit, variation de pH, etc.

      On peut dans les cas les plus favorables, effectuer directement sur le gel une réaction colorée spécifique de l’enzyme. Dans les autres cas, il faudra découper le gel en tranche, éluer ces tranches et doser l’activité enzymatique recherchée dans chaque éluat. Pour ce faire, il est nécessaire :

      - que la stabilité de l’enzyme soit préservée.

      - que la coloration soit conduite rapidement pour éviter la diffusion des composants après l’arrêt de la migration.

==> Par fixation d’un ligand :

Certaines protéines sont capables de se lier spécifiquement à une substance ou lignard. L’utilisation d’un tel lignard marqué (par isotope radioactif, un colorant, un fluorophore, une lectine, …) peut localiser la protéine.

Dans le cas de protéines marquées radio-activement, le gel peut être placé au contact d’un film photographique. La désintégration des isotopes impressionnera le film permettant ainsi la localisation des protéines sur le gel. Il est possible aussi de découper le gel et de le mesurer la radioactivité des différents fragments par autoradiographie. C’est la technique la plus sensible mais elle est souvent longue.

Tableau 01: Principaux colorants utilisés en électrophorèse.

Les gels plats se prêtent mieux aux techniques de révélations des substances radioactives par autoradiographie ou par fluorographie qui sont difficiles ou impossibles à utiliser avec des gels cylindriques. On peut identifier une protéine spécifique sur ce type de gel en la marquant avec un anticorps.