1.      Introduction aux techniques chromatographiques

1.1.  Définitions et principes généraux de la chromatographie :

Le terme de chromatographie fut employé pour la première fois par le botaniste russe Michael Tswett en 1906 pour décrire un procédé de séparation des pigments végétaux colorés ( chlorophylle brute) par passage à travers une colonne remplie d’un adsorbant,  le carbonate de calcium, et éluée avec l’éther de pétrole.

Actuellement, ce terme désigne un ensemble de technique physico-chimiques universellement employées, au laboratoire comme dans l’industrie, tant pour la séparation, plus ou moins sélective, et l’identification des constituants d’un mélanges (qu’ils soient colorés ou non) (chromatographie analytique)  que pour l’obtention à l’état pur d’une certaine quantité de composé destiné à servir ensuite à d’autre usages (chromatographie préparative), en utilisant certaine de leurs propriétés physique et/ou chimiques. Les techniques de chromatographie se sont développées avec une telle rapidité au cours de ces dernières décennies que leur utilisation dans ces domaines est devenue incontournable.

Le principe fondamental des méthodes chromatographique est le suivant : pour séparer deux composés, on exploite leur différence de répartition entre deux phases non miscibles que nous retrouverons toujours dans tous les systèmes chromatographiques :

·         Une phase mobile,

·         Une phase stationnaire.

Les constituants d’un mélange seront plus ou moins retenus sur la phase stationnaire, donc plus ou moins entrainé par la phase mobile, d’où leur séparation par entrainement différentiel.

1.2. Classification des techniques chromatographiques :

Il existe plusieurs variantes de techniques chromatographiques, classées de plusieurs manières différentes (tableau 1) :

Þ    Selon la nature des phases utilisées : la phase mobile être un fluide liquide ou gazeux. Dans le premier cas, on parle de chromatographie en phase liquide (C.P.L.). la phase mobile doit présenter des propriétés physico-chimiques  (pH, force ionique, viscosité ou absorbance) compatible avec la phase stationnaire, le cas échéant avec le type d’interaction recherché, ainsi qu’avec le système de détection utilisé. Le mélange à analyser est alors en solution dans l’eau ou dans un solvant organique. Dans le deuxième cas, on parle de chromatographie en phase gazeuse (C.P.G.) ou en phase vapeur (C.P.V.P). Le mélange à analyser doit préalablement être apporté à l’état de gaz et entrainé dans le système chromatographique par une phase mobile faite d’un gaz inerte dont le seul rôle est un entrainement passif. La phase stationnaire(ou phase fixe) peut être une phase solide ayant des propriétés adsorbantes  ou bien une phase liquide imprégnant un support solide inerte (ex : de l’eau imprégnant un papier).

Þ    Selon la technologie de la séparation : la chromatographie en phase liquide comprend la chromatographie sur papier, la chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie sur colonne. Dans cette dernière, la phase mobile peut être un liquide approprié qui circule à travers la colonne sous pression constante et assez élevée (chromatographie liquide haute performance ou haute pression, CLHP). Dans le premier cas on peut aussi utiliser une pompe péristaltique délivrant une pression faible et permettant de contrôler le débit de passage de la phase mobile.

Tableau 01 : Relation entre le mécanisme de séparation et le système                 chromatographique.

(1) Fixé sur un support solide inerte.

(2) Ionique (sel, acide, base)

(…) Signifie système peu utilisé.

Þ    Selon la nature du facteur déterminant la séparation : la chromatographie liquide sur colonne permet de réaliser tous les types de chromatographie. Dans cette technique, la colonne peut être remplie par un adsorbant (chromatographie d’adsorption), un solide inerte imprégné d’un liquide hydrophile (chromatographie de partition en phase normale) ou hydrophobe (chromatographie de partition en phase inverse), un solide portant des groupes ionisables (chromatographie d’échange d’ions), un solide de porosité calibrée ( chromatographie d’exclusion moléculaire) ou un solide portant des groupements caractéristique spécifiques (chromatographie d’affinité).                               

 1.3. Description générale d’une séparation chromatographique et mécanismes mis en jeu 

Quelques soit la méthode pratique utilisée, on peut toujours raisonner en se ramenant au cas d’une colonne dans laquelle est fixée la phase stationnaire ; et dans laquelle on fait passer, de haut en bas, la phase mobile (figure 01).

Figure  01 : Déroulement d’une séparation chromatographique sur colonne.

Les corps à séparer (dissous dans la phase mobile) apportés en haut de la colonne vont se répartir entre les deux phases selon leur coefficient de partition, caractéristique d’un corps donné :

K_C1 = coefficient de partage de C₁ = concentration de C₁  dans P₁ / concentration de C₁ dans P₂

Ainsi les corps ayant des coefficients de partition différents pour le couple phase stationnaire-phase mobile utilisé, migreront à des vitesses différentes le long de la colonne, et sortiront donc successivement de celle-ci.

On appelle « élution de la colonne » la circulation de la phase mobile au contact de la phase stationnaire. On parle alors d’éluer la colonne. On dit aussi éluer un composé : cela signifie le faire sortir de la colonne en éluant celle-ci avec une quantité suffisante de phase mobile.

Il existe plusieurs mécanismes qui permettent la séparation de composés différents lors de leur élution. En réalité, au cours d’une séparation chromatographique classique, plusieurs de ces mécanismes interviennent simultanément. Il y en a, cependant, toujours en majeur, dont le nom sert à qualifier le principe général de la chromatographie réalisée.

Il ne faut pas (sauf l’exception de la chromatographie d’affinité) que les composés à séparer forment des liaisons covalentes solides avec la phase fixe. Ils ne pourraient alors plus se déplacer.

Les substances éluées passent de la phase mobile dans le détecteur et sont enregistrées par l’enregistreur. En fin de chromatographie, on obtient un chromatogramme ou profil chromatographique ou profil d’élution du mélange, constitué d’un ensemble de pics caractéristiques des corps séparés.

Les pics donnent des renseignements qualitatifs et quantitatifs sur le mélange analysé (chromatographie analytique) :

 -   Information qualitative : les substances séparées sont caractérisées par leur volume d’élution (volume de phase mobile qui s’écoule entre l’injection de  l’échantillon et son apparition à concentration maximale dans le détecteur) tous deux constants dans des conditions expérimentales données. Les conditions chromatographiques sont : la colonne de séparation, la nature de la phase stationnaire, la composition de la phase mobile, le débit de la phase stationnaire, la composition de la phase mobile, le débit de la phase mobile, éventuellement la taille de l’échantillon et la température.

Pour l’identification d’un pic, il suffit donc simplement d’injecter les substances à analyser et de comparer les temps de rétention ou les volumes d’élution avec ceux de substances témoins.

 -  Information quantitative : la surface du pic est proportionnelle à la quantité d’échantillon injecté. Si l’on injecte différentes solutions de concentrations bien connues, si l’on détermine les surfaces des pics et si l’on dessine une courbe d’étalonnage, on peut déterminer à partir de la surface de pic d’un échantillon inconnu, la concentration de ce même échantillon.    

La chromatographie est aussi utilisée pour la purification de substances (chromatographie préparative) à l’échelle du laboratoire comme à l’échelle industrielle dans les domaines les plus variés. 

1.      LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

2.1. Principe

 Cette  chromatographie  liquide-liquide  est  fondée  sur  la  répartition  différentielle  de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles, l’un constituant la phase stationnaire, l’autre la phase mobile. C’est une technique essentiellement qualitative. Cette technique est un peu comparable à une extraction liquide-liquide. 

2.2. Théorie de la partition

  La  distribution  d’un  soluté  A  entre  deux  solvants  non-miscibles,  l’un  aqueux  (S aq),

l’autre organique (S org), relève de l’équilibre     A _{S org}           A _{S aq}  . La constante d’équilibre, qui est appelée  « coefficient  de  partage »  ou  « coefficient  de  distribution »,  est  égale  à 

          [A _Sorg]

K  =   [A_{S aq} ]    .  C’est  l’équation  de  Nernst  pour  le  partage  d’une  substance  entre  deux  phases liquides non miscibles, avec [A _Sorg]: la concentration en soluté A dans la phase organique et [A_{S aq} ]: la concentration en soluté A dans la phase aqueuse. En général, le soluté est plus miscible dans le solvant organique que dans le solvant aqueux et K est donc supérieur à 1.

           La transposition de cette partition d’un composé entre deux phases liquides dans un système chromatographique est rendue possible par la fixation de l’un des solvants sur un  support  inerte,  l’autre  solvant  constituant  la  phase  mobile  (figure  5.1).  Un  soluté  très soluble dans la phase fixée migrera lentement, la force de rétention prédominant sur la force d’entraînement. A l’inverse, un soluté soluble dans la phase mobile migrera rapidement.

 Comme nous l’avons déjà indiqué, c’est une technique essentiellement qualitative. 

-    Sur colonne : La colonne est remplie d’un support inerte imprégné du solvant fixe, le tout constituant la phase stationnaire. Or, les supports sont rarement totalement inertes, il est donc difficile de déterminer ce qui relève du partage et de l’adsorption (dont nous parlerons ultérieurement). Autrement dit, les solutés vont être séparés selon deux mécanismes : le partage et l’adsorption. 

-    Sur papier : En chromatographie ascendante ou descendante. Ici aussi l’intervention du  papier  ne  peut  être  négligée :  on  assistera  à  un  mélange  de  phénomènes d’adsorption et de partage. 

-    Sur  couche  mince :  le  support  inerte  du  liquide  qui  constituera  la  phase  mobile  est coulé sur une plaque de verre. Les solvants migreront par capillarité.

2.      LA CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION

3.1. Principe

           Cette  chromatographie  liquide-solide  est  basée  sur  la  répartition  des  solutés  entre l’adsorbant  fixe  et  la  phase  liquide  mobile.  Chacun  des solutés  est  soumis  à  une  force  de rétention (par adsorption) et à une force d’entraînement par la phase mobile. L’équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation. 

3.2. Adsorption vs absorption

       L’adsorption est un phénomène de surface par lequel des molécules se fixent sur la  surface  d’un  adsorbant,  selon  divers  processus  plus  ou  moins  intenses.  Le  phénomène inverse,  par  lequel  les  molécules  adsorbées  sur  une  surface  s’en  détachent  se  nomme  la désorption. Il existe différents types d’adsorption :

-    L’adsorption physique ou physisorption met en jeu des liaisons faibles, du type forces  de  Van  der  Waals.  Elle  est  en  général  réversible  et  un  équilibre  de  partage s’établit entre la phase mobile et la phase fixe.

-    L’adsorption  chimique  ou  chimisorption  met  en  jeu  des  liaisons  fortes  dont l’énergie est comparable à celle de formation des liaisons chimiques. Elle est souvent irréversible (formation de liaisons covalentes) ou difficilement réversible (formation de liaisons ioniques) et engendre une couche monomoléculaire.

L’absorption,  par  contre,  est  un  phénomène  de  profondeur,  par  lequel  une substance s’incorpore dans une autre substance.

3.3. Les adsorbants

           Ce sont des solides très divisés (l’adsorption est un phénomène de surface), ainsi, 1 g d’alumine pour chromatographie peur représenter une surface de l’ordre de 100 m ^2. 

           On peut distinguer :

-    Les  adsorbants  à  faible  capacité  d’adsorption,  comme  le  talc  ou  le  carbonate  de sodium.

-    Les adsorbants forts, comme le gel de silice, l’alumine ou le charbon actif. Certains adsorbants présentent une forte polarité électrique, comme le gel de silice ou l’alumine alors que d’autres, comme le charbon actif ou les phases inverses ont une faible polarité.

3.4. Les solvants

           Pour un système chromatographique donné (caractérisé par une phase stationnaire, une température, une pression et un soluté), le pouvoir éluant dépend de la polarité du solvant. Prenons, par exemple, une phase stationnaire constituée d’un adsorbant polaire (le gel de silice), d’un soluté polaire adsorbé et d’un solvant polaire (la propanone). Le solvant polaire  possède  un  pouvoir  éluant  élevé,  fortement  adsorbé,  il  déplace  le  soluté.  En revanche,  un  solvant  apolaire  comme  l’éther  de  pétrole  possèdera  un  mauvais  pouvoir éluant,  mais  entraînera  un  soluté  apolaire.  Le  tableau  suivant  reprend  quelques  solvants classés dans l’ordre croissant de polarité (série éluotropique).

Éther de pétrole

 Dichlorométhane

 Propan-1-ol

Cyclohexane  Éther diéthylique  Éthanol

Tétrachlorométhane  Trichlorométhane  Méthanol

Trichloroéthène  Éthanoate d’éthyle  Eau

Toluène  Pyridine  Acide éthanoïque

Benzène  Propanone  

Technologie

             La chromatographie d’adsorption est appliquée selon différentes techniques : 

-    Sur  colonne :  ouverte  à  pression  ambiante,  en  flash  chromatographie,  à  moyenne pression, en CLHP (chromatographie liquide haute performance ou haute pression).

-    Sur  papier :  en  chromatographie  ascendante  ou  radiale ;  dans  cette  technique,  le papier joue le rôle de phase fixe.

-    Sur  couche  mince :  le  gel  adsorbant  (cellulose,  silice)  est  coulé  sur  une  plaque (verre, aluminium, plastique), mélangé à un liant (plâtre).

 4. LA CHROMATOGRAPHIE D’ADSORPTION EN PHASE INVERSEE

4.1. Principe

           C’est  une  chromatographie  d’adsorption  liquide-liquide  dans  laquelle  la  phase stationnaire se distingue par son apolarité. Elle est constituée, la plupart du temps, par des  silices  apolaires  greffées  (figure  5.6).  Il  existe  des  greffons  apolaires  de  tailles différentes, de 2 à 18 atomes de carbone (C2 à C18), donc de polarité différentes.

 4.2. Technologie

           Dans    la    pratique,    cette    chromatographie    ne    s’applique    qu’en    CLHP (Chromatographie Liquide à Haute Performance ou Pression) que l’on désigne souvent sous son  sigle  anglais  HPLC  (pour  High  Pressure  Liquid  Chromatography).  Cette  technique s’applique bien à la séparation de petites molécules peu polaires : lipides, acides aminés, peptides.

 4.3.  Notion de paire d’ions

           Les  composés  ioniques  tels  que  A -   ou  C +   se  séparent  mal  dans  ce  type  de chromatographie,  d’où  l’utilisation  d’une  technique  appelée  paire  d’ions :  on  forme  un ensemble neutre et apolaire tel que (A -  / X + ) ou (C +  / Y - ) qui est chromatographié.

 5.    CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER

 5.1. Principe de la technique et applications:

 La technique ressemble à celle de la CCM mais le principe repose sur des phénomènes de partage. La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau; la phase stationnaire est constituée par l'eau elle-même adsorbée sur la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en chromatographie sur couche mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant, qui se déplace par capillarité, fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.

Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y être assez solubles. Des produits comme l'acide éthanoïque, le propanol, le phénol ou la pyridine sont les solvants les plus fréquemment utilisés en mélange avec de l'eau pour développer un chromatogramme.

La chromatographie sur papier est employée principalement pour l'analyse de composés très polaires, tels les acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels. Ses plus grands inconvénients par rapport à la CCM sont:

·         une durée de développement beaucoup plus longue

·         une séparation généralement moins bonne.

5.2. Papier:

 On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se procurer du papier conçu pour cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et dont les caractéristiques sont uniformes. Les marques principales sont Whatman, Schleicher et Schüll, Durieux, Arches. Il existe huit catégories de papier Whatman, classés selon leur épaisseur, la texture de leur surface et la vitesse avec laquelle l'eau y diffuse. Par exemple le papier Whatman n° 1 est le plus utilisé, mais si on désire une grande vitesse d'écoulement, on emploiera le n° 4; le papier n° 20 est très lent, mais il permet une meilleure séparation, donnant des taches très denses et uniformes.

La description de l'analyse par chromatographie sur papier est identique à celle sur couche mince.

 6.    CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (C.C.M)

            Il s’agit d’une méthode chromatographique qui permet, suivant un procédé simple et rapide, l’identification et la séparation d’un très grand nombre de substances organiques et même minérales. La phase stationnaire peut être solide (chromatographie d’adsorption) ou un liquide imbibant un support solide (chromatographie de partition). Dans le premier cas, les substances à séparer sont adsorbée à la surface du solide (constituée d’une poudre fine) étalé en couche mince régulière sur un support. Ce dernier peut être une plaque de verre ou une feuille d’aluminium ou de polyester (plastique rigide). Les dimensions standards sont 20x20 cm et parfois 10x10 cm ou 5x7 cm.

6.1. Nature des phases utilisées :

6.1.1. Phases stationnaires :

            La phase solide intervient plus ou moins directement comme phase stationnaire, c'est-à-dire comme phase intervenant dans l’équilibre de distribution des substances séparer.

            Les phases stationnaires les plus utilisées sont :

·      Gel de silice non hydraté ;

·      Alumine (AI₂O₃).

       Pour ces deux phases, le solide intervient directement dans la fixation des composés à séparer.

·       Kieselguhr : c’est un gel de silice plus hydraté que le précédant. Pour cette raison, il est moins actif que lui pour fixer directement des composés, les sites de fixation étant occupés par des molécules d’eau. On s’est sert en chromatographie de partition, comme support de la phase stationnaire qui est l’eau.

·       Cellulose : elle intervient aussi surtout comme support d’une phase stationnaire aqueuse en chromatographie de partition.

·       Le gel de silice peut contenir un produit fluorescent. Ce produit apparait vert vif quand on l’éclaire avec un rayonnement ultraviolet de longueur d’onde 254 nm. Ce gel de silice est noté F₂₅₄.  Il permet de repérer facilement sur la plaque les composés qui absorbent l’ultraviolet : ils apparaissent sous forme de tâches sombres sur un fond fluorescent.

·       On trouve aussi des gels de silice modifiée par réaction chimiques et qui présentent de ce fait d’autres caractéristiques de séparation plus sélectives. Les modifications peuvent être des groupes fonctionnels chimiquement tels que les groupes alkyles, diol, amino, cyano ou également des groupes qui conviennent à la séparation de substances douées d’activité optique.

 6.1.2. Phases mobiles :

              La phase mobile est un liquide non miscible avec la phase stationnaire et choisi en fonction de la polarité des substances à séparer. Elle est constituée, en général, d’un mélange de différents solvants organiques (tableau 2), ou bien de solutions aqueuses de pH et de force ionique définis. Souvent, des mélanges de 2 ou 3 solvants de polarités différentes donnent de meilleures séparations que des solvants chimiquement homogènes. En partition, les systèmes de solvants utilisés dans la chromatographie sur papier sont entièrement applicables. Son choix est très important pour la réussite de la séparation.

   Tableau 02 : Solvants utilisés en chromatographie sur couche mince classés par polarité croissante.

6.2.  Préparation des phases :

              Le verre est le support le plus utilisé pour sa résistance mécanique et thermique mais son cout d’utilisation reste élevé. Il peut être remplacé par les feuilles de polyester ou d’aluminium, plus économique. Le polyester est un matériau flexible, résistant à tous les solvants courants, pouvant être découpé au format désiré à l’aide de ciseaux, et s’utilisant à des températures relativement basses (< 60 °C). Les phases en aluminium renforcé présentent les avantages du polyester tout en supportant des températures plus élevées. Les solvants à forte proportion d’acides minéraux ou d’ammoniaque ne doivent pas être employés avec ce type de plaques.

              On trouve dans le commerce des plaques « prêtes à l’emploi », c'est-à-dire comportant sur le support de verre ou de polyester un film de phase stationnaire d’épaisseur parfaitement connue. Elle varie entre 0.25 et 2.0 mm.

On distingue :

·         Les films d’épaisseur 0.25 ou 0.5 mm. On ne peut y déposer que de faibles quantités de produits. Ils conviennent pour l’analyse qualitative ou semi-quantitative.

·         Les films d’épaisseur 1.0 ou 2.0 mm. On peut y déposer des quantités plus importantes de produit. Ils sont utilisés quand on veut récupérer ensuite quantitativement le produit, ou bien si on veut en purifier une grande quantité (chromatographie dite préparative).

On peut aussi préparer ces plaques soi-même. Il faut pour cela :

-Des supports de couches minces (plaques de verre).

-La phase stationnaire voulue, à l’état de poudre.

-Un appareil à étaler cette phase. Il comporte un étaleur et un support sur lequel in dispose les plaques de verre.

              On prépare un mélange homogène de phase stationnaire (éventuellement additionnée d’un liant) et d’eau, placé dans l’étaleur. Celui-ci est réglé pour l’épaisseur désirée de la couche mince. On le fait ensuite circuler une fois à vitesse constante et assez vite sur les plaques à préparer de manière à répartir sur ces plaques une couche régulière de produit.

              On laisse ensuite sécher à l’air ces plaques puis on les place sur un portoir dans une étuve afin de le « activer », c'est-à-dire d’enlever les molécules d’eau des sites de fixation pour les produits à séparer.

              Le tableau 03 indique, pour les différentes phases stationnaires possibles, les caractéristiques à respecter pour préparer les plaques. Il donne aussi les mécanismes de séparation utilisés pour chacune de ces phases, ainsi que la nature moléculaire des composés que l’on peut séparer sur chacune.

6.3.    Préparation de la cuve à développement :

              La phase mobile est située au fond de la cuve à chromatographie et monte par capillarité à partir du bord de la plaque qui y est trempé (fig.2). Il  faut une hauteur de 1 à 2 cm de phase mobile au fond de la cuve.

Tableau 03 : choix et préparation du support en chromatographie sur couche mince.

Figure 02 : conduite d’une chromatographie sur couche mince.

              Pour accélérer la montée par capillarité, l’atmosphère de la cuve doit être saturée par les vapeurs de la phase mobile. Pour cela, la cuve est fermée hermétiquement, et éventuellement, ses parois internes sont tapissées de papier filtre. Cette préparation doit se faire au moins ¼ d’heures avant de commencer le développement du chromatogramme.

 6.4.   Dépôt des échantillons sur les plaques :

              L’échantillon doit être en solution dans un très faible volume de solvant qui sera ensuite évaporé. Il est parfois nécessaire (échantillon dilués) de faire plusieurs dépôt du même échantillon au même endroit. Il faut alors sécher entre chaque dépôt à l’aide d’un sèche-cheveux. Les dépôts sont faits avec précaution, à l’aide d’une pipette capillaire à usage unique, de telle sorte à être situés juste au-dessus du niveau de la phase mobile quand la plaque sera mise dans la cuve (fig. 2).

              On dépose plusieurs échantillons de différents produits, en général, sur une même plaque de même que les produits purs de référence dont on recherche la présence sur cet échantillon complexe. L’intervalle entre les dépôts soit alors être de 1 à 2 cm, à partir d’une distance de 2 à 3 cm des bords de la plaque.

 6.5.   Développement :

            On pose la plaque dans la cuve, une fois les dépôts bien secs, doucement, sans remous. On ferme la cuve et on n’y ouche plus jusqu’à la fin du développement. Par effets de capillarité, le solvant monte, entrainant avec lui les composants de l’échantillon à des vitesses différentes selon leur distribution entre les deux phases utilisées d’où leur séparation.

            Quand la phase mobile a migré au 2/3 ou au ¾ de la hauteur de la plaque, on enlève celle-ci, on la pose à plat pour la faire sécher et on relève tout de suite, d’un trait au crayon la position du front du solvant.

Figure 03: chromatographie bidimensionnelle

Comme  indiqué  en  (a),  on  commence par   réaliser   la   chromatographie   de façon    classique    avec    un    certain système   de   solvants.   Nous   aurons donc   une   première   séparation.   La plaque  est  ensuite  tournée  à  90°  et une  nouvelle  élution  est  réalisée  avec un autre système de solvants (b).

6.6.   Révélation :

            La position des tâches est révélée de diverses façons.

            Dans le cas de substances colorées, leur détection peut se faire à l’œil nue. Les substances incolores doivent être rendues visibles par vaporisation d’un réactif approprié sur la plaque. Celui-ci, en se combinant aux substances, donne un complexe coloré. Le tableau 4 donne la liste non exhaustive et les applications de plusieurs de ces réactifs. Ces derniers peuvent révéler tous les composés organiques.

            Exemple : pulvérisation d’acide sulfurique puis chauffage à 100°C à l’étude. Les tâches de tous les composés organiques apparaissent noirs calcinées.

            Ces réactifs peuvent aussi être plus ou très spécifiques d’une classe ou d’un nombre limité de composés. Tous forment des dérivés colorés avec les produits qu’ils révèlent.

 Tableau 04 : Révélation utilisés en chromatographie sur couche mince.

N.B. La pulvérisation de ces réactifs nécessite d’avoir un pulvérisateur soit muni d’une poire déformable, soit équipé d’un réservoir de gaz interne sous pression.

            Dans le cas de composés absorbant d’ultraviolet ou bien fluorescent, on les met en évidence par utilisation d’une plaque contenant un produit fluorescent et en la visualisant dans un endroit sombre, par une lampe à ultraviolet. Ces plaques contiennent un indicateur fluorescent permettant une résolution dans l’UV proche (366 nm) ou lointain (254 nm). L’indicateur UV₂₅₄ est un silicate de zinc activé au manganèse, dont le maximum d’absorption est à 254 nm. Il présente une fluorescent verte. Il est sensible aux acides et sa fluorescence peut être éteinte par des solvants acides. L’indicateur UV₃₆₆ est également un pigment minéral dont le maximum d’absorption est 366 nm. Il présente une fluorescence bleue. Dans le cas d’une absorption de l’ultraviolet, les constituants de l’échantillon désactivent la fliorescence du matériau de sorte que la plaque est fluorescente partout sauf aux endroits ou se trouvent les constituants. On peut alors cerner d’un trait fin de crayon, les tâches qui apparaissent sombre sur un fond clair ou les tâches brillamment colorées (produits fluorescents). Cette technique n’est pas destructrice et permet, par conséquent, une récupération ultérieure éventuelle des composés.

6.7.   Interprétation des chromatogrammes :

            La migration d’une tâches sur un chromatogramme se quantifier par son Rf qui est égal à la distances parcourue par le solvant depuis la ligne de dépôt/distance parcourue par le solvant depuis la ligne de dépôt.

            La reconnaissance de différents composants se fait par comparaison de leur Rf et / ou de leur coloration avec celles de substances témoins ayant subies le même traitement. Pour obtenir des Rf reproductibles, il est nécessaire d’opérer dans des conditions identiques : composition identique d’éluant, température constante, cuve saturé, etc.

             La valeur du Rf est comprise entre 0 (produit ne migrant pas) et 1 (produit n’étant pas retenu). Une présomption d’identification existe quand, dans le mélange complexe, le composé étudié a le même Rf que le composé sur la référence.

            Plusieurs produits peuvent cependant avoir le même Rf. On peut essayer de les différencier par des révélations plus spécifiques. On peut aussi changer de système chromatographique en modifiant d’abord la phase mobile et, éventuellement, la phase stationnaire. En particulier, quand un mélange contient beaucoup de corps différents, on l’analyse souvent par une chromatographie bidimensionnelle (fig.3). La capacité de résolution de la méthode en est améliorée.

            N.B. l’identification du Rf d’un produit doit se faire en meme temps que celle, précise, des conditions expérimentales : nature des phases fixe, mobile, activation de la plaque, etc.

6.8.   Application :

            Comme pour les autres techniques chromatographiques, les trois aspects fondamentaux de la chromatographie sur couche mince sont les suivants :

1.      L’analyse qualitative, qui permet de déterminer le nombre des constituants dans un mélange inconnu ainsi que leur nature :

2.      L’analyse préparative, qui permet de préparer une certaine quantité, à l’état  pur, de substances pour des études chimiques ou physico-chimiques ;

3.      Enfin, l’analyse quantitative, qui consiste à déterminer les proportions exactes de chacun des constituants du mélange.

Les avantages d’une séparation par CCM résident dans son coût très faible et dans sa rentabilité. Un seul passage permet de séparer plusieurs échantillons à la fois, les uns à coté des autres. Cette technique est particulièrement indiquée comme technique d’essai ; ses résultats peuvent être extrapolés immédiatement à la technique en colonne dans la mesure où on utilise les mêmes phases stationnaires et les mêmes phases mobiles. Une mise au point rapide sur une plaque CCM permet en outre de trouver les conditions optimales de séparation pouvant être transposées en chromatographie sur colonne, généralement beaucoup plus laborieuse.

            Ainsi, la CCM est une excellente méthode pour procéder à une analyse, préliminaire ou de routine, de mélanges complexes et pour y rechercher la présence ou l’absence de tel ou tel composé particulier.

6.9.   Dosage et récupération des produits :

              A partir des produits séparés sur une couche mince, on peut procéder à deux types de dosage :

              Le premier type de dosage est dit « semi-quantitatif ». Cela signifie, en fait, qu’il ne donne qu’un ordre de grandeur de la concentration et non une valeur précise. Il consiste à estimer sur le chromatogramme l’intensité de la coloration de la tâche du produit à doser par rapport à l’intensité de la coloration de tâche témoins issues de dépôts de quantités connues de solutions étalons du même produit.

              Le deuxième type de dosage est précis, il est dit « quantitatifs ». On récupère alors totalement en solution le produit de la tâche à doser, à condition qu’il n’ait pas été irréversiblement transformé par les conditions de révélation. On applique ensuite sur la solution obtenue des méthodes plus précises de dosage (essentiellement spectroscopiques). Il faut, bien sûr, comme dans le cas du dosage semi-quantitatif, bien connaitre le volume initialement déposé sur la plaque de l’échantillon complexe.

              Pour récupérer totalement le produit d’une tâche en solution, on repère d’abord au crayon fin les contours de la tâche. On gratte avec une spatule la phase stationnaire contenant la tâche que l’on dépose sur un papier filtre. On procède ensuite à l’élution du produit isolé à l’aide d’un solvant. Dans le cas des gels de silice ou d’aluminium on utilise souvent comme solvant l’alcool méthylique ou le dichlorométhane, selon la polarité des produits isolés.

5.     CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION MOLECULAIRE

7.1. Principe :

Ce type de chromatographie, également appelé tamisage moléculaire ou gel-filtration, vise à séparer les molécules en fonction de leur masse moléculaire bien que la forme intervienne également. Toutes les autres interactions fonctionnelles sont réduites au minimum par la phase mobile.

Le principe consiste à faire migrer l'échantillon à analyser au milieu de billes poreuses (la phase stationnaire). Les molécules suffisamment petites pour passer par les pores des billes seront ralenties dans leur progression, alors que les molécules trop grosses pour entrer dans les billes progresseront plus rapidement en passant entre les billes (voir fig. 4). Elles sont, donc, éluées du gel dans l’ordre des masses moléculaires décroissantes.

Figure 4 : Principe de la chromatographie d’exclusion moléculaire.

7.2. Les supports chromatographiques :

  Il existe un grand nombre de phases stationnaires constituants un tamis moléculaire. Elles diffèrent surtout par leur porosité et, donc, par leur capacité à retenir ou non des molécules d’une taille donnée. La limite d’exclusion correspond au PM, pour un type de polymère donné, au-dessus duquel les analystes ne peuvent pas du tout pénétrer dans les pores et ne sont donc pas séparés. Le domaine de fractionnement d’un gel donné identifié l’intervalle de PM entre la molécule la plus grande pénétrant totalement dans les pores et la molécule la plus petite exclue. Les supports chromatographiques peuvent être constitués de polymères organiques, naturels ou artificiels, ou bien d’un support minéral greffé à un réseau organique.

 Tableau 05 : Gels couramment utilisés en chromatographie d’exclusion moléculaires et leurs domaines de fractionnement

Les polymères organiques naturels utilisés comme tamis moléculaire sont des polyosides formés de chaines d’α-glucose et nommés dextranes. Les dextranes réticulés possèdent les plus petits pores, avec des limites d’exclusion correspondant à des PM allant de moins de 1000 à prés de 800 000 (tableau 05). A l’intérieur des groupes, le choix est dicté par la taille des particules. En général, le débit est plus élevé avec des particules de grande taille qu’avec des particules de petite taille, mais la résolution est moins bonne.

7.2.1. Les phases mobiles :

              Les phases mobiles sont généralement des phases aqueuses de faible salinité (par exemple, solution de NaCI 9%) ou d’un léger pouvoir tampon (par exemple, tampon phosphate 0,05 M, pH 7,0). Pour certaines phases stationnaires, on peut utiliser une phase mobile organique (ex : Sephadex LH 20).

Les résultats lors d’une filtration sur gel sont généralement exprimés sous la forme d’un diagramme d’élution montrant la variation de concentration du soluté en fonction du volume d’élution.

Le recueil de l’éluât se fait à l’aide d’un collecteur de fraction, fonctionnant soit selon le réglage du temps, soit selon le comptage de gouttes (fig. 5 et fig. 6). Le détecteur est souvent spectroscopique.

Figure  05 : Collecteur de fractions.

               A partir de ces courbes, on peut donc connaitre le volume d’élution (Ve) d’une molécule donnée. C’est le volume d’éluant nécessaire pour provoquer la sortie de la substance hors de la colonne. Le volume d’élution Ve n’est pas suffisant en lui-même pour définir le comportement chromatographique d’un soluté. Il dépond aussi du volume total (Vt) du lit de gel et du volume mort de la colonne (Vo).

              Le coefficient de partage du soluté entre la phase liquide et la phase gel, Kav, caractérise mieux son élution :

                                    Kav=Ve - Vo/ Vi = Ve – Vo / Vt – Vo où

              Vo : volume vide ou volume mort ou volume d’exclusion. Il représente le volume d’élution d’une substance totalement exclue du gel. Vo est identique au volume du liquide interstitiel entre les grains du gel.

Figure 06: Séquence des opérations depuis le dépôt de l’échantillon jusqu’à l’établissement du diagramme d’élution.

              Kav est compris entre 0 (corps exclu) et 1(corps totalement retenu).

              Vi correspond au volume de solvant contenu dans le gel. On le mesure par l’opération suivante : on pèse à l’état sec la phase fixe qui servira pour la colonne (masse m₁). On la repèse ensuite après l’avoir laissé gonfler dans la phase mobile et en avoir rempli la colonne (masse m₂). Connaissant la masse m₃ de la colonne vide, Vi est alors égal à Vi (ml)= m₂ (g) – (m₁ + m₃ ) – Vo.

              Dans une chromatographie d’exclusion moléculaire, il ne faut pas que se développent des interactions chimiques entre la phase stationnaire et les molécules à séparer telles que des phénomènes parasites d’adsorption de ces dernières sur le gel. Ces interactions modifient l’ordre naturel de sortie des molécules. Leur volume l’élution peut dépasser Vo + Vi c'est-à-dire Vt. Les rapports Ve / Vt ou Ve / Vo, sont également utilisés mais ils dépendant de la qualité de remplissage de la colonne.

              Les relations approximatives entre quelques uns de ces paramètres sont montrées à la figure 07.

Figure 07 : Relation entre les différents paramètres utilisés en filtration sur gel.

7.3. Applications de la chromatographie d’exclusion moléculaire :

7.3.1. Détermination de poids moléculaire :

              C’est une technique courante pour la plupart des protéines qui ont une structure globulaire. En effet, il existe une relation simple entre le Kav et le poids moléculaire (PM) de la substance (fig. 08). Pour chaque type de gel, il existe une zone de PM où le Kav varie linéairement avec le logarithme du PM.

Figure 08 : Courbe d’étalonnage établie à l’aide de protéine étalons (PM connu).

              Les constantes a et b sont fonction du gel. Il est seulement nécessaire de déterminer les volumes d’élution pour des composés de poids moléculaires connu. On trace ensuite le graphe représentant ce volume en fonction du logarithme du poids moléculaire. On mesure alors le volume d’élution de la substance inconnue et on lit le PM sur le graphe.

              Cette méthode est rapide et permet, en outre, de déterminer les poids moléculaires de plusieurs molécules d’une même solution en une seule expérience. Elle présente, cependant, un inconvénient : la séparation dépend des propriétés physiques des molécules en solution et on obtient des résultats anormaux avec des molécules asymétriques (glycoprotéines, lipoprotéines et protéines non globulaires). Pour contourner ce problème, on peut dénaturer le composé (avec du chlorure de guanidium, ou de l’urée par exemple), ce qui permet de déterminer le poids moléculaire des sous-unités constitutives de la protéine oligomérique.

              En pratique, on détermine d’abord le volume mort (ou vide) en introduisant un petit volume d’une solution d’une substance de heut poids moléculaire, par exemple le Bleu Dextran (PM = 2 000 000) et on élue avec le solvant. Le volume d’élution est égal au volume vide. La colonne est alors étalonnée avec des protéines témoins de poids moléculaires connu. On suit l’élution de ces protéines par mesure de l’extinction à 280 nm. On peut ainsi porter les volumes d’élution des protéines témoins en fonction du logarithme de leur PM.

  7.3.2. Dessalage des protéines :

              Le dessalage a été l’une des premières applications de la filtration sur gel et demeure l’une des plus importantes.

              On entend par dessalage non seulement l’élimination des sels des solutions de macromolécules mais aussi, l’élimination des autres composés de faible PM. Ainsi, la production du lait sans lactose est considérée comme une opération de dessalage. Dans cette opération, les substances de PM élevé qui doivent être dessalées migrent habituellement dans le volume vide, c'est-à-dire qu’elles sont totalement exclues du gel, alors que les composants de faible PM sont répartis à peu prés également entre la phase stationnaire et la phase mobile. La séparation entre composants lourds et composants légers étant très bonne, on peut utiliser des grands volumes d’échantillons, on peut utiliser en pratique des volumes d’échantillons allant jusqu’à 30% du volume total du gel. Cette méthode de dessalage a de nombreuses applications. Elle est plus rapide et plus efficace que la dialyse et est, de ce fait, souvent utilisée pour le dessalage de substances labiles d’origine biologique (acides nucléique, par exemple).

 8. CHROMATOGRAPHIE D’ECHANDE D’IONS (CI)

8.1. Principe de l’échange d’ions :

Cette technique de chromatographie est orientée vers la séparation des ions et des composés polaires. Pour cela on utilise des colonnes contenant des phases stationnaires comportant des sites ioniques pour qu’il se crée des interactions dipolaires avec les analytes à séparer. Plus grande est la charge portée par un soluté, plus ce dernier est retenu par la phase stationnaire. Ce processus d’échange est lent, comparé à ceux qui régissent les autres types de chromatographie. Parmi les composés séparables en CI on trouve les mono ou polysaccharides, les nucléosides et nucléotides, les acides carboxyliques les anions et cations organiques ou minéraux divers (métaux de transition, terres rares)...

 Les parties au contact de la phase mobile doivent être en matériaux inertes compte tenu de l’agressivité des solutions aqueuses acides ou basiques qui servent d’éluants. La progression et la séparation des composés de l’échantillon reposent sur des phénomènes d’échanges ioniques. On distingue deux situations :

➤ Si on cherche à séparer des espèces cationiques (type M⁺), on choisit une colonne, appelée cationique, dont la phase stationnaire comporte des sites aptes à échanger les cations. Une telle phase est constituée par exemple par un polymère greffé avec des groupements − SO3H (c’est par conséquent l’équivalent d’un polyanion).

➤En revanche, si on cherche à séparer des anions (type A⁻) on choisit une colonne dite anionique. Celle-ci est obtenue par exemple à partir d’un polymère comportant des groupements ammonium). Pour comprendre le mécanisme d’une séparation, prenons pour exemple une colonne anionique  comportant  des  groupements  ammonium  quaternaire,  en  équilibre  avec  une phase mobile riche en anions hydrogénocarbonates (contre-anions). Ainsi, tous les sites cationiques de la phase stationnaire se trouvent appariés avec les ions de la phase mobile (fig. 09).

Figure 09: Illustration de la progression d’un anion A⁻ au contact d’une phase stationnaire ammonium appariée avec un contre-anion E⁻ de la phase mobile. L’ion E⁻  (généralement l’ion hydrogénocarbonate) est fixé sur la phase stationnaire. L’anion A⁻  (ion chlorure par exemple), qui est dans la phase mobile vient prendre la place de l’ion E⁻. Ensuite, l’élution produit une inversion du sens de la réaction d’équilibre en régénérant, au niveau du site considéré, la phase stationnaire liée à un ion E⁻ (ou un autre ion de même type). La progression de A− dans la colonne dépendra de son affinité avec les sites ioniques de la colonne.

Lorsqu’un anion A⁻, apporté par l’échantillon, est entraîné par l’éluant, une suite d’équilibres réversibles se produit, régis par une équation d’échange qui détermine sa répartition entre les deux phases, mobile (PM) et stationnaire (PS). Le sens 1 correspond à la fixation de l’anion A⁻ sur la PS et le sens 2 à son retour dans la PM, donc à sa progression dans la colonne.   

Ce phénomène d’échange qui permet de retenir les espèces polaires sur la résine est connu sous le nom d’extraction en phase solide. Si l’échantillon contient deux ions X etY et si KY  > KX, Y est plus retenu par la colonne que X.

8.2. Les phases :

8.2.2. Phases stationnaires

Les phases stationnaires doivent satisfaire aux impératifs de distribution granulométrique étroite (monodisperse), de grande surface spécifique, de résistance mécanique, de bonne tenue aux pH acides ou basiques et assurer un transfert rapide des ions.

8.2.2.1. Copolymères de synthèse

Les phases stationnaires les plus connues sont obtenues par copolymérisation styrène/divinylbenzène afin d’obtenir des phases réticulées, résistantes à l’écrasement. Elles se présentent  sous  forme  de  particules  sphériques  d’un  diamètre  de  quelques  micromètres (fig. 10). Ces particules sont ensuite greffées pour en faire des polyanions ou polycations. Pour greffer des groupements SO3H, on fait réagir de l’acide sulfurique concentré, sachant que seuls les noyaux aromatiques accessibles au réactif seront transformés. On obtient une phase très acide — dite cationique forte — dont l’anion est fixé sur le copolymère et le cation est échangeable avec d’autres espèces cationiques présentes dans l’éluant. La capacité d’échange, indépendante du pH de la solution, est de quelques mmol/g.

Figure 10 : Phases stationnaires en CI.

Schéma  d’une  particule  sphérique  de  polystyrène  à  usage  d’échangeur  de  cations.

Matrice de polystyrène transformée en résine échangeuse de cations (ex. DOWEX®  4 ou en résine échangeuse d’anions (ex. DOWEX® MSA-1, ou Permutite® si R = Me).

Pour réaliser une résine anionique en partant du même copolymère, on commence par une chlorométhylation, ce qui revient à fixer − CH2Cl (obtention de la « résine de Merrifield ») puis on fait réagir une amine tertiaire ou secondaire selon la basicité souhaitée de la phase stationnaire.

        Une phase stationnaire faiblement basique comme Polym-NMe 2 donne au contact de l’eau une phase faiblement ionisée (Polym-NMe 2 H) + OH− surtout si on est en milieu alcalin. En revanche, en milieu acide, elle apparaîtra comme une phase fortement basique dont la surface active sera fortement ionisée : (Polym-NMe 2 H) + Cl−. Les résines de ce type ont une capacité d’échange qui varie avec le pH.

8.2.2.2. Silices greffées

Le gel de silice peut également servir de support pour fixer, par des liaisons covalentes, des chaînes alkylphényles porteuses de groupements sulfonés ou ammonium quaternaire. La démarche est semblable à celle qui est suivie pour obtenir les silices greffées de la CLHP. Ces phases associent les propriétés de la chromatographie ionique à celles de la CLHP. La séparation repose à la fois sur les coefficients ioniques et sur les coefficients de partage.

Figure 11: Copolymérisation de deux monomères monoéthyléniques (un acide et un trihydroxyamide). Exemple  de  structure  obtenue  (CM-TRISACRYL  M®   de IBF-France).  S’agissant  d’un  acide  faible une  phase  de  ce  type  n’est  pas  utilisable  à  des  pH acides,puisqu’elle n’est plus sous forme ionisée.

        Un autre procédé pour obtenir ces phases stationnaires consiste à copolymériser un mélange de deux monomères acryliques, l’un de type anionique (ou cationique) choisi selon la nature de la phase désirée, et l’autre polyhydroxylé (fig. 11), destiné à assurer le caractère hydrophile. Mais ces résines ont un inconvénient, car leur taux de gonflement varie en fonction de la composition de la phase mobile. Elles sont réservées au domaine de la chromatographie moyenne pression, pour certaines applications biochimiques.

8.2.2.3. Résines pelliculaires

Un polymère appelé latex, préparé au départ d’un monomère porteur de fonctions organiques, est déposé à l’état de minuscules sphères jointives (0,1-0,2 mm de diamètre) pour former une pellicule continue de 1 à 2 mm d’épaisseur sur un support imperméable, constitué de microsphères de silice, de verre, ou de polystyrène de 25 à 50 mm de diamètre (fig. 12) propre à conduire à des équilibres rapides entre phases.

Figure 12 : Résines pelliculaires.

Exemple de résine constituée d’un noyau dur sur lequel a été déposé un copolymère obtenu au départ d’un monomère résultant de la réaction de l’acide maléique sur le 1,3-butadiène (Reproduit avec l’autorisation de la Société Dionex).

Dans le cas du support polystyrène, le latex est fixé par des liaisons polaires. Ce latex résulte de la réaction de deux monomères insaturés tels que le 1,3-butadiène avec l’acide maléique ou le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle. Les doubles liaisons restantes servent à durcir le matériau par réticulation.

8.2.3. Phases mobiles

Les éluants servant de phases mobiles sont des solutions aqueuses chargées d’ions salins ou organiques et, si nécessaire, d’un peu de méthanol ou d’acétone pour faciliter la dissolution de certains échantillons. Suivant le type, cationique ou anionique de la colonne, les ions de l’éluant sont apportés soit par des acides minéraux ou organiques (perchlorique, benzoïque, phtalique, méthanesulfonique...), soit par des bases (hydroxyde de potassium ou de sodium, carbonates ou bicarbonates...).

Dans ce dernier cas, les solutions d’élution ont malheureusement tendance à se carbonater par absorption du dioxyde de carbone de l’air ambiant, ce qui perturbe progressivement les temps de rétention. Pour éviter cette contamination, on peut acquérir par exemple un générateur d’hydroxyde de potassium (KOH) qui s’intercale entre la pompe et l’injecteur du chromatographe. Connaissant le débit d’eau et l’intensité du courant d’électrolyse on règle avec précision la concentration en KOH de l’éluant et on peut même faire des séparations reproductibles avec des gradients de concentration.

8.3. Application de la chromatographie d’échange d’ions :

               La chromatographie d’échange d’ions est particulièrement utilisée pour séparer entre elles des molécules ionisables appartenant à une même famille chimique. Le cas le plus classique en est celui des protides.

              Les acides aminés peuvent être fractionnés en trois groupes. Il y a des acides aminés retenus par des échangeurs d’anions (Dowex 2, Amberlite IRA400, etc.) et des acides aminés retenus par les échangeurs de cations (Dowex 50, Amberlité IRC50, etc.) et des acides aminés neutres non ou peu retenus sur ces résines dans les mêmes conditions.

              Il existe également un système de fractionnement, complètement automatisé, qui permet de séparer, d’identifier et de doser quantitativement tous les acides aminés d’un hydrolysant protéique en 2 à 4 heures et de déceler 10 nanomoles d’acides aminés. On les dépose sur la colonne en solution acide, de sorte que tous soient d’abord retenus sous forme de solution RNH₃^+.  On réalise ensuite un gradient d’élution où le pH et la force ionique augmentent peu à peu. Les acides aminés sont élués les uns après les autres et mélangés automatiquement à la ninhydrine (qui réagit avec leurs NH₂) à la sortie de la colonne puis le tout est conduit au bain marie où la réaction colorée au lieu. L’intensité est lue grace à un colorimètre à 750 et 440 nm. Cette dernière longueur l’onde est utilisée pour déceler uniquement la proline et l’hydroxyproline. Le chromatogramme (fig. 18) apparait sur un enregistreur qui peut être combiné à un intégrateur des surfaces sous les pics. L’ensemble des opérations est automatisé dans les appareils spécialisés appelés « auto-analyseur d’acides aminés ».