L’hybridation moléculaire

Elle permet la recherche ou la reconnaissance d’un fragment d’ADN dans un mélange de fragments. elle s’appuie sur les deux propriétés fondamentales de la molécule d’ADN :

• Celle de passer de façon réversible de l’état double brin à l’état simple brin, ou la dénaturation des brins d’ADN ou inversement la renaturation, il y a rupture des liaisons entre les bases sous l’action de la température et/ou d’agents chimiques et donc séparation des brins. L’abaissement de la température provoque la renaturation des brins : hybridation.

• Celle de la loi de complémentarité entre les bases de l’ADN: paires A-T et G-C.

Avec hybridation, il est possible de voir si l’ADN contient une séquence ou un gène particulier. Ce par l’utilisation d’un fragment d’ADN marqué soit radioactivement, soit chimiquement et qui correspond à une séquence connue: la sonde. En utilisant le phénomène de renaturation et d’appariement des bases d’ADN, il est possible de repérer la molécule comportant la séquence complémentaire à la sonde.

Les molécules cibles d’ADN à caractériser sont au préalable rendues simple brin et fixées sur une membrane d’hybridation en nylon.

La sonde simple brin radioactive par accrochage in vitro de 32P (isotope radioactif du phosphore) sur les nucléotides. Ou bien non radioactive dite froide, par des nucléotides marqués à l’aide de groupements chimiques spécifiques comme la biotine par exemple. Elles sont mises en contact avec la molécule cible dans des conditions permettant la renaturation.

-La sonde reconnaît alors son homologue: il y a hybridation.

-Un lavage permet d’éliminer l’excédent de sonde.

                         La réaction de polymérisation en chaine:

OU Polymerase Chain Reaction est une technique permettant d’obtenir, à partir d’un échantillon d’ADN, d’importantes quantités d’une séquence d’ADN spécifique.

Cette amplification repose sur la réplication d’une matrice d’ADN double brin. Elle se décompose en trois phases : une phase de dénaturation, une phase d’ hybridation avec des amorces et une phase d’élongation. Les produits de chaque étape de synthèse servent de matrice pour les étapes suivantes, ainsi on réalise une amplification exponentielle. La PCR permet de multiplier de l’ADN en grande quantité, elle permet:

• De déterminer si l’ADN transféré est intégré dans le patrimoine génétique de la cellule. La PCR permet de réaliser ce diagnostic rapide de présence éventuelle de l’ADN transféré, sur de faibles quantités d’ADN.

• Le marquage. La PCR abou ti t à la cr é a ti on de nouveaux ty pes de marqueurs, qui r é v è lent polymorphisme de fragment d’amplification. Ce sont des marqueurs simples d’utilisation.

-Le clonage et le séquençage de gènes sont également simplifiés.

Ses principales étapes sont:

La dénaturation :

C’est la séparation des deux brins d’ADN, obtenue par élévation de la température.

 L’hybridation :

En abaissant la température, les amorces spécifiques s’hybrident sur les molécules simple brin d’ADN. Les amorces sont constituées de courtes séquences d’ADN complémentaires de la séquence de l’ADN à amplifier. Il s’agit toujours d’un couple d’amorces, complémentaire encadrant le fragment d’ADN à amplifier.

L’élongation :

C’est la synthèse du brin complémentaire. Une enzyme polymérase, la Taq polymérase, ajoute à l’extrémité de l’amorce des oligonucléotides présents dans le milieu de réaction.

Un cycleur, sorte de bain-marie, où les montées et descentes en température sont programmées, permet de réaliser un nombre de cycles déterminé.