La centrifugation est essentiellement un moyen de séparer les particules d’une solution. En biologie, les particules sont souvent des cellules, des organites (mitochondries, chloroplastes, etc.) ou de grosses molécules (protéines, acides nucléiques, virus, etc.).

La séparation centrifuge est une variante accélérée de la sédimentation où l’accélération naturelle de la pesanteur (g = 9,81 m.s ^-1) est remplacée par une force centrifuge engendrée par le rotor d’une centrifugeuse tournant à grande vitesse.

Il existe deux types de centrifugation : une dite préparative qui permet d’isoler des particules spécifiques, l’autre est appelée analytique permettant de mesurer des propriétés physiques des particules.

3.1. Théorie de base de la sédimentation 

En l’absence d’agitation, des particules dispersées dans un fluide sont soumises, d’une part, aux forces de pesanteur qui tendent à les faire sédimenter au fond du récipient et, d’autre part, à la poussée d’Archimède qui tend à les faire remonter à la surface : le mouvement des particules  dépend donc de l’intensité relative de ces forces. Si elles sont égales, les particules flottent, sil la pesanteur l’emporte, les particules sédimentent, et cela d’autant plus vite que leur différence de densité avec le milieu de dispersion est grande.

En tournant un rotor dans une centrifugeuse, une force centrifuge est appliquée  à chaque particule dans l’échantillon et chaque particule sédimente à une vitesse proportionnelle à la force centrifuge qui lui est appliquée. La viscosité de la solution contenant l’échantillon et les propriétés physiques de la particule affectent aussi la vitesse  de sédimentation de chaque particule individuellement.

A une force centrifuge et à une viscosité du liquide donné, la vitesse de sédimentation de la particule est proportionnelle à la taille (poids moléculaire) et à la différence entre sa densité de la solution.

Lors d’une centrifuge qui tend à les faire sédimenter et, par conséquent, à établir un gradient de concentration, du sommet vers le fond du tube de centrifugation.

A la diffusion qui tend, au contraire à les maintenir en solution uniforme s’opposant à l’établissement de gradient de concentration.

A fin de permettre aux particules de sédimenter, il convient d’utiliser des vitesses de centrifugation suffisamment élevées pour que la force centrifuge, f, vainque les forces de diffusion (Figure 11).

Le coefficient de sédimentation, s, d’une substance désigne sa vitesse de sédimentation dr/dt rapportée au champ de gravité ὠ² r :

                                     S = (dr/dt).(1 / ω² r)

Avec r = distance à l’axe de rotation (cm)

ω = vitesse angulaire (radian.sec ^-1)

Figure 11 : Principe de la centrifugation.

 La dimension de s est un temps, son unité le Svedberg (S) : 1 S= 10^-13sec. Ainsi, une particule dont le coefficient de sédimentation est égale à 10^-12sec = 10.10^-13 sec, a une valeur de 10 S.

Bien que le coefficient de sédimentation augmente avec la poids moléculaire, il ne lui est pas proportionnel, puisqu’il est également influencé par les résistances de friction du solvant et par la forme de la particule. Cependant, dans certaines conditions, le poids moléculaire M d’une protéine peut être calculé à partir du coefficient de sédimentation grâce à l’équation de Svedberg obtenue en annulant la force centrifuge par la force de friction qui s’y oppose, ce qui se produit quand la vitesse de sédimentation est constante :

 -          La force centrifuge à laquelle est soumise une molécule de la substance dissoute est :

F = M(1 – υρ) ω²r

            υ = volume partiel spécifique de la substance. Il correspond à l’augmentation de volume produite quand 1g de soluté sec est ajouté à un grand volume de solvant.

            ρ= densité du solvant

-          La force de friction est :

f’ = F.dr/ dt

F= coefficient de friction, est égal à RT / D

R = constante des gaz parfait (8.315 10⁷ ergs. mol^-1.degré ^-1

T = température absolue (°K)

D= coefficient de diffusion (cm².s^-1) dans l’eau à 20 °C, D = D_20,w

Quand f = f’, on a:  

M( 1 – υρ )ω²r = (RT/ D) (dr / dt)

D’où :

M = RTs / D (1 – up)              équation de Svedberg

Cette équation montre que la masse d’une particule est proportionnelle à son coefficient de sédimentation est inversement proportionnelle ou coefficient de diffusion. Par exemple, une particule ayant un petit poids moléculaire, doit avoir un petit coefficient de sédimentation et devrait montrer une tendance à diffuser rapidement dans les solutions de faible viscosité.

3.2. Instrumentation 

Si la vitesse de rotation est inférieure à 10 4  tours/min, on a une centrifugeuse. L’ultracentrifugeuse peut atteindre 100 000 tours/min, ou plus et produire un champ de gravité suffisant pour sédimenter les particules ou molécules de masse supérieure à 10 000 daltons.

Les centrifugeuses et ultracentrifugeuses sont composées des éléments suivants :

-          Un moteur capable de tourner jusqu’à plusieurs dizaines de milliers de tours par minute,

-          Un rotor, capable de supporter des rotations aussi rapides (en titane généralement pour les rotors des ultracentrifugeuses). Le rotor porte des emplacements, situés symétriquement de part et d’autre de l’axe, destiné à recevoir des tubes contenant les solutions biologiques.

-          Une enceinte dans laquelle est disposé le rotor, qui est réfrigérée et sous vide poussé dans le cas des ultracentrifugueuses pour éviter l’échauffement exagéré du à la friction du rotor contre l’air et faciliter le contrôle de la température,

-          Cette enceinte est, de plus, blindé pour éviter des accidents en cas d’explosion du rotor.

Les rotors sont de trois types :

·         A angle fixe pour les séparations les plus simples entre culot (cellules, organites, membranes, protéines) et le surnageant (Figure 12 A). Ces rotors sont utilisés surtout pour des séparations séquentielles, à des vitesses de rotation croissantes,

·         A godets mobiles, utilisés pour des séparations plus fines, parce que la force de centrifugation s’exerce dans le sens de la longueur du godet (Figure 12 B). En effet celui-ci est mobile autour de son point de suspension à l’axe du rotor et s’oriente en cours de rotation pour que l’axe reste colinéaire avec le champ. On peut alors séparer des particules, essentiellement en fonction de leur densité, en utilisant des gradients de densité,

·         Analytique, utilisés pour une mesure très précise des coefficients de sédimentation.

Figure 12 : Rotor angulaire (A) et rotor à godets mobiles (B).

 3.3. Méthodes de séparation par ultracentrifugation préparative 

3.3.1. Centrifugation différentielle 

      C’est la méthode la plus commune. Elle permet d’isoler des structures intracellulaires, à partir d’un homogénat initial, en procédant à différentes centrifugations à des vitesses croissantes.

      Le tube de centrifugation est rempli initialement avec un mélange uniforme d’une solution d’échantillon. Après centrifugation, d’abord à basse accélération (ex : 1000g, 10 minutes), on obtient une séparation de deux fractions : un culot contenant les éléments les plus denses qui se disposent au fond des tubes de centrifugation et une solution surnageant de particules non sédimentées (Figure 13).

Figure 13 : Centrifugation différentielle.

Les deux fractions sont récupérées par décantation du surnageant. Celui-ci peut être recentrifugé à des vitesses plus élevées (ex : 20 000g, 20 minutes) pour obtenir une purification supplémentaire avec formation d’un nouveau culot et d’un nouveau surnageant (Figure 28). Le culot peut être recentrifugé en augmentant constamment la vitesse de rotation (ex 80 000g, 1 à 2 heures puis 150 000g, 3à5 heures, etc), après sa remise en suspension dans un petit volume de solvant approprié. Cette méthode est utilisée pour fractionnement des constituants cellulaires. Les principales étapes nécessaires au fractionnement complet des cellules sont résumées dans la figure 14. Cette technique d’ultracentrifugation ne permet cependant pas la séparation de tous les organites intracellulaires. Ainsi, le plus souvent, les fractions mitochondriales et lysosomales sont mélangées et ne peuvent être séparées complètement.

Figure 14 : Fractionnement cellulaire par centrifugation différentielle.

3.3.2. Centrifugation en gradient de densité 

      Cette technique est plus compliquée que la précédente mais présente des avantages supplémentaires. Elle nécessite l’établissement d’un gradient de densité dans le tube de centrifugation. Le fluide du gradient de densité est constitué d’un soluté de faible poids moléculaire dans un solvant contenant les particules de l’échantillon suspendues. Le gradient de densité utilisé ici est un élément auxiliaire : il sert simplement à stabiliser les produits séparés dans des zones en évitant les courants de convection.

      Il existe deux méthodes de centrifugation en gradient de densité :

3.3.2.1. Centrifugation de zone ou zonale 

      Dans cette technique, un faible volume de suspension contenant les produits à analyser est déposé sur une colonne de gradient préformé.

      Dans la plupart des techniques courantes, un gradient de densité continu (5 à 45% , par exemple) de saccharose (exemple, 5 à 45%) est d’abord préparé dans un tube à centrifuger en plastique par un système qui mélange une solution concentrée de saccharose à de l’eau dans un rapport décroissant au fur et à mesure que le tube est rempli, de telle sorte que la densité du milieu soit la plus grande à l’extrémité inferieure du tube (Figure 15). Un petit volume du mélange à séparer est déposé à la partie supérieure du gradient. L’ensemble est soumis à centrifugation à des vitesses et pendant des durées qui dépendent du but recherché. La centrifugation à grande vitesse du tube dans un rotor à godets mobiles, en position horizontale, amène chaque type de particules à sédimenter à sa propre vitesse déterminée essentiellement par le poids de la particule, mais aussi par sa densité et sa forme, ce qui se traduit par des bandes séparées ou zones.

      Habituellement, la centrifugation est arrêtée lorsque l’équilibre est atteint. La position des bandes peut être localisée optiquement ou par le recueil soigneux du contenu du tube en perçant un trou de petite taille à son extrémité inferieure ; des échantillons successifs sont recueillis dans une série de petits tubes qui seront analysés dans l’ordre de leur recueil. En déterminant la concentration en protéines pour chaque fraction par mesure de la densité optique à 280 nm, on détermine la répartition des protéines dans le tube, ce qui permet de les classer selon leur masse.

Le tube plastique peut également être congelé et coupé en couches minces pour une analyse éventuelle.

Cette technique est principalement employée pour séparer les molécules d’ADN, d’ARN ou les structures ribonucléoprotéique selon leur taille.

Figure 15 : Conduite d’une centrifugation zonale.

3.3.2.2. Centrifugation isopycnique 

      Ce type de centrifugation utilise une substance en solution très dense d’un sel tel que le chlorure de césium 6M à laquelle est mélangé l’échantillon à séparer. Pendant la centrifugation, le chlorure de césium sédimente en formant un gradient de concentration stable entre le sommet et le fond du tube (Figure 16). A cette variation de concentration est liée une variation de densité ou gradient de densité. Ce gradient de densité atteint un état d’équilibre après un certain temps de centrifugation ; celui-ci dépend de la vitesse de centrifugation, de la hauteur de la colonne liquide, de la nature du sel et de la température.

Si on mélange initialement une particule avec la solution saline tell que sa densité encadre celle de la particule, cette dernière formera une bande plus ou moins étroite dans le tube de centrifugation à la position où sa masse volumique est égale à celle de la solution saline. On dit alors que les particules sont isopycniques par rapport au milieu. Il existe des tables fournissant les masses volumiques de nombreuses particules (vésicules membranaires, organites, etc.) qui permettent de séparer les unes des autres les différentes particules en choisissant convenablement le gradient fabriqué.

Figure 16: Centrifugation isopycnique.

 Lorsqu’on centrifuge deux espèces de macromolécules dont les densités apparentes sont différentes elles occupent dans le tube de centrifugation des positions différentes, on réalise une séparation de macromolécules basée sur leurs différentes de densités apparente et non plus leurs coefficients de sédimentation. Même dans un champ de gravité très intense, les particules ne peuvent sédimenter au delà de la région du gradient de même densité qu’elles.

Les gradients se densité sont établis à l’aide de composés très solubies dans l’eau, capables de modifier très sédimentation la densité (ou masse volumique) du milieu. Le composé le plus utilisé dans la formation d’un gradient de densité pour une sédimentation à l’équilibre, st une solution aqueuse de chlorure (CsCl). Il s’établit un gradient contenant   plus d’ions Cs+ (et plus de Cl- qui se déplace en même temps que le Cs+ pour neutraliser les charges) au fond du tube qu’au sommet. Dans une centrifugation typique, le milieu de centrifugation est d’environ 0.02 mg/ml plus dense au dans une solution de CsCl, sont respectivement de 1.3 de 1.6 à 1.7 et de 1.75 à 1.8 g/ml environ, et donc  facilement séparables.

Dans une solution de CsCl, les ions se lient aux protéines et aux acides nucléiques ; l’ion Cs+ se lie aux groupes phosphate de l’ADN, et dans l’ARN,  aux groupes phosphate ainsi qu’aux fonctions hydroxyles des riboses, ce qui augmente plus la densité de l’ARN que celle de l’ADN.

Pour séparer les protéines ou les organites, on utilise souvent des gradients de concentration de saccharose ou de dextran (sucre polymèrisé).

Cette centrifugation à l’équilibre a une très grande résolution et est particulièrement utile pour distinguer des macromolécules dont le ¹²C ou le ¹⁴N habituel est substitué par les isotopes lourds ¹³C ou ¹⁵N. Ainsi, lorsque des cellules sont cultivées avec des isotopes lourds, il est possible de séparer physiquement les molécules fabriquées par la cellule, avant l’addition de ces isotopes lourds, de celles fabriquées après. Une illustration parfaite de cette application a été l’expérience de Stahl montrant la réplication semi-conservative de l’ADN.

3.4. Séparation par ultracentrifugation analytique 

Une centrifugeuse analytique (Figure 17) possède un système d’observation et de mesure permettant de suivre la migration des particules dans une solution homogène au cours de l’expérience, autorisant ainsi la détermination du coefficient de sédimentation (s), à l’aide d’une mesure optique de la concentration (absorbance) ou d’une variation de concentration (différence d’indice de réfraction).

                                  Figure 17 : Ultracentrifugeuse analytique.

3.5. Contrôle du résultat de la centrifugation 

Quelque soit la variante technique employée pour la préparation de fractions cellulaires, on doit toujours s’assurer que la fraction recueillie ne contient que l’organite ou les particules à étudier et qu’il n’existe pas dans cette préparation d’éventuelles contaminations par une autre fraction cellulaire. Ce contrôle peut être fait soit grâce à des critères morphologiques (microscopie électronique), soit grâce à des critères biochimiques (recherche d’enzymes marqueurs).

Ainsi, les phosphatases acides et la β-glucuronidase  caractérisent les fractions lysosomales ; la catalase, les peroxysomes. Les transférases d’oses sont spécifiques des vésicules golgiennes et la 5’-nucléotidase est l’enzyme la plus spécifique de la membrane cytoplasmique. Enfin, pour les mitochondries, la membrane externe peut être marquée par la présence de la monoamine oxydase alors que la membrane interne l’est par la présence de la succino-deshydrogénase.

De plus, il convient de bien choisir préalablement le tissu que l’on va utiliser en fonction de l’organite à étudier : le tissu hépatique convient particulièrement à l’étude des mitochondries alors que les hématies constituent le matériel de choix pour toute recherche portant sur les membranes plasmiques.

 3.6. Quelques aspects de la réalisation pratique des centrifugations 

Les gradients de densité utilisée en centrifugation isopycnique sont des gradients à l’équilibre ; ils s’établissent au cours de la centrifugation.

De manière générale, on mélange initialement les macromolécules à centrifuger avec la solution saline dont la densité a été convenablement choisie.

Si on se propose de préparer v ml d’une solution dont la densité est ρ, la masse m_o de sel à utiliser est donnée par :

m_o = v. ρ .F

F étant la fraction en poids du sel dans une solution aqueuse donnée et la masse m de tampon, ou de solution macromoléculaire ou d’eau à ajouter est :

 M = v. ρ - m_o

C’est ainsi que pour obtenir 3ml de CsCl à la densité ρ =1.760 (F = 0.589), on a pesé :

            m_o = 3 . 1,760 – 3,110 = 2,170 ml de tampon.

Il est bon de vérifier que la solution finale a bien la densité voulue. On peut le faire soit par pycnomètrie, soit par réfractométrie. Dans le second cas, on utilise la relation qui existe entre densité et indice de réfraction des solutions salines concentrées.

Exemple : cas du CsCl à 25 °C

ρ²⁵ = 10,2402 η²⁵ – 12,6483 pour les densités comprise entre 1,00 et 1,38

ρ²⁵ = 10,681 η²⁵ – 13,4974 pour les densités supérieures à 1,37.

A la fin de la centrifugation, les macromolécules forment des bandes étroites dans le tube de centrifugation et on peut, ainsi, déterminer la position, éventuellement la forme. A cette fin, on collecte le contenu du tube de centrifugation de la même manière que lors de la centrifugation de zone….