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• Méthode de séparation
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    I. Filtration                                         

    La filtration s’adresse à des suspensions de particules. La filtration est un procédé permettant de séparer une phase continue (liquide ou gazeuse) et une phase dispersée (solide ou liquide) initialement mélangées. Le liquide ayant subi la filtration se nomme filtrat et le filtre retient un résidu appelé rétentat ou encore parfois gâteau.

    1 Classification

    1.1 En fonction de la taille moyenne des particules à retenir par le filtre

    La filtration sous vide ou sous pression ou filtration clarifiante s’adresse à des particules dont la taille est supérieure à 1 µm.

    La microfiltration (MF) est un procédé permettant de séparer les particules dans une gamme de 0,1 à 10 µm en appliquant des basses pressions de l’ordre de 0,2 à 2 bar.

    L’ultrafiltration (UF) est une technique de séparation sélective permettant la concentration de suspensions solides et de solutés de poids moléculaire (PM) supérieur à 1 000. Elle nécessite l’utilisation de pression pouvant aller jusqu’à 145 psi (10 bar).

    La nanofiltration (NF) est un procédé sélectif à utiliser lorsque l’ultrafiltration ne donne pas de résultats satisfaisants. Elle permet d’éliminer les petites molécules ( M > 300 g/mol).

    1.2 En fonction du mode de passage du fluide

    La filtration frontale est la configuration la plus usuelle dans les applications analytiques.

    La configuration tangentielle, Elle est utilisée dans les entreprises de biotechnologie pour des applications telles que la purification des vaccins, d’anticorps monoclonaux ou de protéines recombinantes.

    2 Mécanismes de la filtration

    Les mécanismes mis en jeu s’exercent selon les filtres en surface (criblage ou tamisage) ou en profondeur par absorption.

    Le criblage, les particules restent sur le filtre qui ne retient pas la phase.

    La filtration en profondeur, dans lequel le réseau poreux des filtres retient les particules par des effets mécaniques (sédimentation) ou électrostatiques (adsorption).

    3 Matériel

    3.1 Filtrants de média

    3.1.1 Papiers-filtres

    Les papiers-filtres sont classiquement des filtres en cellulose (filtres ronds, papier plissé, ou cartouche épaisse).

    D’autres matériaux, comme des fibres PVC ou des fibres de verre (borosilicaté ou microfibres de quartz), sont retenus lorsque les papiers en cellulose n’offrent pas la stabilité chimique ou thermique requise..

    À côté de ces filtres classiques, de nombreux filtres tissés sont proposés :

    – les filtres en fluorocarbone, les filtres en nylon, les filtres en polyester, les filtres en polyéthylène, les filtres en polypropylène.

    3.1.2 Membranes filtrantes

    Les membranes sont particulièrement performantes dans les applications nécessitant des vitesses élevées et des volumes élevés. Le passage de milieux liquides à travers une membrane se fait sous l’action d’un gradient de pression.

    Les différents matériaux constitutifs sont les suivants pour les membranes de nature organique : nitrate et acétate de cellulose, PTFE ( Téflon®) [poly(tétrafluoréthylène)], PVDF [poly(fluorure de vinylidène)], PSE (polyéthersulfone),  polycarbonate, polyamide (Nylon®).

    Il existe enfin des membranes minérales constituées de couches céramiques poreuses (oxyde de zirconium, alumine, oxyde de titane) qui présentent une grande inertie chimique et une excellente résistance mécanique et thermique.

    3.2 Supports

    Pour les filtres en profondeur, tout système de base emploie un entonnoir à 60°, si on n’utilise que la gravité comme force externe, ou des unités de filtration sous vide ou sous pression.

    Pour les membranes, on retrouve le même type d’unités, associées parfois à des cellules à agitation pour contrôler les phénomènes de colmatage au voisinage du filtre, mais également à des capsules ou des cartouches de filtration et des unités de filtration adaptables directement à des seringues.

    3.3 Critères de choix

    Le choix du média dépend :

    – de la nature de ce qui est filtré

    – du degré de filtration requis ;

    – du débit souhaité ;

    – de la pression disponible.

    Les paramètres à prendre en compte pour le choix d’une membrane sont les suivants :

    – la taille des pores ;

    – le caractère hydrophile ou hydrophobe ;

    – les propriétés chimiques du fluide à traiter ;

    – la température ;

    – le débit ;

    – le tolérance à la pression ;

    – la rétention – adsorption.

    4. Domaines d’applications

    Le champ d’applications des techniques de filtration est extrêmement vaste dans les domaines:

    – agro-alimentaire (jus de fruits, lactosérum...);

    – traitement des eaux

    – l’industrie automobile avec le dégraissage et le traitement des huiles;

    – biotechnologique et pharmaceutique

    5. Conclusion

    En dehors de la filtration, les membranes ont d’autres applications à des fins analytiques. Elles peuvent être utilisées en dialyse, osmose inverse, pour la purification, l’enrichissement, l’addition contrôlée de réactifs, ou dans des systèmes d’échantillonnage et de couplage entre un procédé et des systèmes d’analyse. De très nombreuses applications dans des domaines aussi variés que la production d’eau, l’agro-alimentaire, la production de médicaments et les laboratoires d’analyses biologiques ou chimiques mettent en œuvre les techniques de filtration.

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  • Sélectionner l’activité II. Chromatographie

    II. Chromatographie (1) : Aspects généraux

    1. Introduction :

    La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation des constituants d’un mélange homogène liquide ou gazeux. Cette méthode  a un très grand domaine d’applicabilité et par suite se trouve très répandue. Aucun laboratoire analysant des composés moléculaires ne peut ignorer la chromatographie.

    2. Historique :

    Certains attribuent  l’invention de la chromatographie à Runge en 1855 : il eut en effet l’idée d’utiliser les propriétés de diffusion d’un papier absorbant pour séparer les constituants d’une solution. Mais le nom de chromatographie (dérive du mot grec khrôma qui signifie couleur et graphien qui signifie écrire « écrire en couleur ») est apparu beaucoup plus tard, en 1906 exactement, et c’est au botaniste russe Michel Tswett qu’on le doit.

    En 1903, Tswett eut l’intuition de filtrer de la chlorophylle en solution dans l’éther de pétrole à travers une colonne remplie de craie (CaCO₃) finement pulvérisée, et observa que les composants se déposaient de haut en bas dans la colonne, en formant des zones colorées bien séparées.

    Cette découverte n’eut pas immédiatement les prolongements que l’on pouvait en attendre. La chromatographie a en effet été redécouverte entre 1930 et 1940 et elle connaît depuis un développement continu. Actuellement, certains types de chromatographe permettent la détection de quantités aussi infimes que des parties par billion (ppb) de composés.

    - la chromatographie sur couche mince (CCM) (1938). (TLC : Thin Layer Chromatography).

    - la chromatographie sur papier (1944).

    - la chromatographie en phase gazeuse (CPG) (1952). (GC : Gas Chromatography).

    - la chromatographie sur gel (1959).

    - la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) (1967). (HPLC: High Pressure Liquid Chromatography).

    3. Définition générale :

    La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d’un mélange, dans le but d’identifier ou de quantifier des composés au sein d’échantillons divers. Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases non miscibles (phase fixe dite stationnaire et phase mobile).

    4. Buts de la chromatographie :

    On peut distinguer deux objectifs principaux:

    4.1. Objectif analytique :

    Il s’agit d’identifier des solutés qualitativement et/ou quantitativement. L’échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution-étalon (solution commerciale contenant des substances connues, à des concentrations bien connues). Ces substances servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des vitesses de séparation (et éventuellement d'autres renseignements donnés par la détection).

    4.2. Objectif préparatif :

    On se contente de séparer les fractions, de les récolter pour les identifier par d'autres techniques.

    5. Principes fondamentaux :

    L’expérience de base en chromatographie peut être décrite comme suit (Chromatographie sur colonne):

    1. On immobilise dans une colonne un solide finement divisé appelé phase stationnaire.

    2. On place au sommet de cette colonne un petit volume de l’échantillon à séparer.

    3. On force cet échantillon à traverser la colonne de haut en bas au moyen de la phase mobile afin d’entraîner ses divers constituants. Si les composés présents migrent à des vitesses différentes, ils pourront être recueillis séparément, chacun en solution dans la phase mobile.

    Quel que soit le genre de chromatographie effectué, la séparation des composés d’un mélange est basée sur la distribution différente de ces composés entre une phase stationnaire et une phase mobile. Les composés seront séparés uniquement si certains d’entre eux sont plus fortement retenus par la phase stationnaire, pendant que les autres se déplacent plus rapidement au sein de la phase mobile.

    5.1. La phase stationnaire et ses supports :

    La phase fixe peut être solide ou liquide. Ils peuvent être employés comme :

    -          remplissage d'une colonne (HPLC)

    -          étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (CCM)

    -          un liquide imprégnant un support solide 

    -          une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée).

    -          adsorbés sur papier de la cellulose (C. sur papier)

    -          constituée d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux (CPG).

    5.2. La phase mobile et son déplacement : se déplace à travers la phase stationnaire, en entraînant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.

    La phase mobile est:

    • soit un gaz (CPG): la phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz porteur.

    • soit un liquide (ex: c. sur papier, CCM ou sur colonne): la phase mobile est appelée éluant.

    6. Classification des techniques chromatographiques :

    Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer selon :

    La nature de la phase mobile on distingue:

    -          la chromatographie en phase liquide CPL

    -          la chromatographie en phase gazeuse CPG

    -          la chromatographie en phase supercritique CPS

    La nature de la phase stationnaire on distingue:

    -          la chromatographie gaz / solide CGS

    -          la chromatographie gaz / liquide CGL

    -          la chromatographie liquide / solide CLS

    -          la chromatographie liquide / liquide CLL

    Les interactions développées par la phase stationnaire :
    
    -          la chromatographie d'adsorption
    
    -          la chromatographie de partage
    
    -          la chromatographie à échange d'ions
    
    -          la chromatographie d'exclusion  
    
    -          la chromatographie d'affinité

    7. Nature des phénomènes:

    Il existe en chromatographie plusieurs phénomènes physiques responsables de la rétention plus ou moins forte des composés sur la phase stationnaire. Généralement, on distingue cinq types de phénomènes que nous allons étudier successivement:

    7.1. Phénomène d’adsorption

    Le phénomène d’adsorption est essentiellement un phénomène de surface par lequel les composés sont attirés sur les sites actifs de la phase stationnaire par des liaisons hydrogènes et électrostatiques. La phase stationnaire est un matériau solide en forme de petits granules de différentes grosseurs; les plus utilisées sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose en poudre.

    - Influence de la polarité des composés

    En chromatographie d’adsorption, la capacité d’adsorption des composés sur la phase stationnaire est en relation directe avec leur polarité. Plus un composé est polaire plus fortement, il sera adsorbé sur les sites actifs de la phase stationnaire et moins vite il se déplacera.

    Adsorbants:

    Le gel de silice et l'alumine sont les adsorbants les plus utilisés. En général, plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les composés polaires. Il est cependant possible de traiter un adsorbant pour modifier ses capacités d'adsorption et ses propriétés:

    Plus la teneur en eau d'un adsorbant est faible (ce qui a pour conséquence la présence d'un plus grand nombre de sites d'adsorption pour le soluté), plus il est polaire ou actif.

    Généralement, on utilisera de préférence l'alumine pour séparer des solutés basiques comme les amines et le gel de silice pour les phénols et les acides car les solutés acides sont fortement adsorbés par l'alumine alors que les solutés basiques le sont par la silice.

    - Influence de la polarité de la phase mobile

    Lorsqu’on exploite le phénomène d’adsorption en chromatographie, la polarité de l’éluant a une influence considérable sur la vitesse de déplacement des composés d’un mélange. Plus l’éluant est polaire, plus les composés se déplacent rapidement. En effet, l’éluant est également adsorbé sur les sites actifs de la phase stationnaire et entre en compétition avec les composés du mélange.

    Phase mobile:

    Le pouvoir éluant d'un liquide dépend de sa propre polarité. Les liquides classés ci-dessous le sont par polarité croissante. On obtient ainsi une série éluotropique. (éther de pétrole < cyclohexane < tétrachlorométhane < trichloréthène < toluène < benzène < dichlorométhane < éther diéthylique < trichlorométhane < éthanoate d'éthyle < pyridine < propanone < propan-1-ol < éthanol < méthanol < eau < acide éthanoïque).

    7.2. Phénomène de partition :

    Dans une chromatographie de partition, la phase stationnaire est non pas un solide, mais un liquide fixé physiquement ou greffé chimiquement sur un support solide. Les composés d’un mélange vont donc se solubiliser dans la phase liquide stationnaire, au lieu de s’y adsorber. C’est la solubilité différente des composés dans la phase stationnaire et dans la phase mobile qui rend la séparation chromatographique possible.

    Influence de la solubilité des composés

    - Dans la phase stationnaire :

    Plus un composé est soluble dans la phase liquide stationnaire, moins vite il se déplacera.

    - Dans la phase mobile :

    Plus un composé est soluble dans la phase mobile, plus vite il se déplacera.

    Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage entre chaque phase. On peut séparer des solutés dont les coefficients de partage entre les deux phases sont différents. Un autre facteur qui intervient est la polarité de la phase.

    7.3. Chromatographie ionique:

    La phase mobile est une solution tampon aqueuse et la phase stationnaire la plus courante est constituée de polystyrène sous forme de sphères de quelques micromètres de diamètre, lesquelles ont été chimiquement transformées en surface pour faire apparaître des sites ioniques. Ces phases permettent l'échange de leurs contre-ions mobiles avec des ions, de même signe, présents dans la phase mobile. La séparation repose sur les coefficients de distribution ionique entre les deux phases. La phase solide est une résine insoluble munie de groupes fonctionnels qui sont, habituellement, des groupes « acide sulfonique » (SO3H) pour les échangeurs de cations et « ammonium quaternaire » (N(R)3) pour les échangeurs d'anions.

    7.4. Chromatographie d'exclusion:

    La phase stationnaire est généralement un polymère poreux dont les pores ont des dimensions choisies en rapport avec la taille des espèces à séparer. On réalise une sorte de tamis à l'échelle moléculaire, dit à perméation sélective. Le coefficient de partition s'appelle dans ce cas le coefficient de diffusion. Cette technique est encore appelée filtration sur gel ou perméation de gel selon la nature de la phase mobile (aqueuse ou organique).

    Le diamètre des pores est une caractéristique de chaque type de gel.

    Un mélange de solutés de masses molaires variables traverse une épaisseur donnée de gel: les grosses molécules, celles dont le diamètre est supérieur à celui des pores, sont exclues et éluées les premières; les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses, leur migration est freinée en diffusant dans le gel.

    La séparation est donc réalisée par le fait que les solutés sont élués dans l'ordre inverse des masses molaires.

    7.5. La chromatographie d'affinité :

    Cette technique, encore qualifiée de bio-chromatographie ou encore de bio-reconnaissance, permet de purifier presque toutes les molécules biologiques selon leur fonction ou leur structure chimique individuelle. Il s'agit d'une chromatographie d'adsorption dans laquelle la molécule à purifier est adsorbée spécifiquement de façon réversible sur un ligand immobilisé sur la phase stationnaire. Le facteur de purification est très élevé car l’énergie échangée est très élevée et résulte de l’établissement de nombreuses liaisons souvent de nature différente et coopératives

  • Sélectionner l’activité III. Chromatographie (2)

    III. Chromatographie (2) : Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

    La chromatographie sur couche mince ou chromatographie planaire (CCM, en anglais TLC pour Thin layer chromatography) est une technique de chromatographie couramment utilisée pour séparer des composants dans un but analytique ou préparatif.

    1) Historique :

    Bien que découverte en 1938, ce n’est qu’en 1958 que fut popularisée la chromatographie sur couche mince, telle que nous la connaissons actuellement. Cette technique a rapidement supplanté la chromatographie sur papier, car elle est plus rapide et est utilisée autant pour les composés polaires que non polaires.

    2) Principe :

    Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est placée dans la cuve, l’éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d’une part, des interactions de faible énergie retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.

    3) Applications de la CCM :

    ü Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle facile et rapide de la pureté d’un composé organique (si l’analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la présence d’une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur).

    ü Elle est utilisée pour rechercher les meilleures phases stationnaires et mobiles, avant d’entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne.

    ü Méthode pour trouver la méthode d’élution la plus appropriée (la meilleure élution est celui qui, lorsque la phase mobile a terminé sa migration, a entraîné le soluté à une distance d’environ la moitié de celle qu’il a parcourue).

    4) Appareillage :

    Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont :

    - La cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.

    - La plaque : Une plaque de CCM est un support en verre, en aluminium ou en plastique sur lequel a été étalée une phase stationnaire en couche uniforme. Les plaques peuvent être préparées en répandant à l’aide d’un étaleur une mince couche uniforme de la phase stationnaire sur une plaque de verre, dont les dimensions varient de 2,5 × 7 cm à 20 × 20 cm. On retrouve cependant dans le commerce des plaques prêtes à l’usage avec la phase stationnaire fixée sur une feuille en plastique ou en aluminium. Ces dernières ont l’avantage d’être faciles à entreposer et découpables en bandes selon les besoins de l’expérimentateur.

    – L’échantillon : environ un microlitre (l µl) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser, déposer en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.

    - La phase stationnaire : une couche de matériel adsorbant (usuellement du gel de silice SiO₂, de l'oxyde d'aluminium Al₂O₃, kieselguhr ou de la cellulose) étalé en couche mince (de l'ordre de 100 à 200 μm) sur la plaque. La fixation de la phase stationnaire sur la plaque a été réalisée à l’aide d’un liant qui assure la bonne cohésion de la couche et une bonne adhérence au support (comme le sulfate de calcium hydraté, l’amidon ou un polymère organique). La plupart des plaques commerciales contiennent un indicateur de fluorescence qui permet la visualisation des taches à la lumière ultraviolette (UV) à 254 nm; à cette longueur d'onde, l’indicateur émet une lumière, verte en général, sauf aux endroits où un produit absorbe le rayonnement UV ce qui provoque l'apparition de taches sombres.

    - La phase mobile : une phase liquide dite l’éluant, est un solvant ou un mélange de solvants qui migre lentement le long de la phase stationnaire par capillarité, entraînant les composés à séparer.

    Choix de l’éluant dans le cas d’analyses :

    – d’hydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène.

    – de groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole mélangés en proportions variables avec du benzène ou de l’éther diéthylique forment un éluant de polarité moyenne.

    – de composés polaires : Acétate d’éthyle, propanone ou méthanol.

    5) Mode opératoire (voir ci-dessus):

    Les principales étapes d’une chromatographie sur couche mince sont :

    a) Préparation de la plaque :

    On réalise une activation de la plaque par chauffage à l’étuve pour évaporer toutes molécules d’eau imprégnées sur la phase stationnaire (phénomène d’adsorption).

    b) Préparation de l’éluant et de la cuve :

    On prépare à côté, un éluant qui recouvrira le fond de la cuve sur environ 5mm de hauteur, et on laisse saturer la cuve (c'est-à-dire : laisser la cuve fermée et laisser les vapeurs de l'éluant 'remplir' le volume de la cuve, environ 5-10 min).

    c) Préparation et déposition des échantillons inconnus et des standards :

    L’échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n’est pas forcément le même que l’éluant : on emploie fréquemment le trichlorométhane (chloroforme), la propanone ou le dichlorométhane.

    On trace au crayon de papier un trait horizontal (la ligne de base) à environ 1 cm du bas de la plaque de CCM. Les marques A et B représentent respectivement le produit de départ (standard) et le brut réactionnel (l’échantillon).

    On dépose légèrement et brièvement, à l'aide d'une micropipette ou d’un tube capillaire, une petite quantité d'une solution du produit de départ sur la marque A et une petite quantité du brut réactionnel sur la marque B. Dans cet exemple, le produit de départ est incolore (cercle en pointillé) alors que le brut réactionnel est légèrement coloré.

    Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible; idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm. Ce sont généralement les dépôts les moins étalés qui permettent les meilleures séparations. Pour augmenter la quantité déposée, il est toujours préférable d’effectuer plusieurs dépôts au même point, en séchant rapidement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule fois un grand volume d’échantillon qui produirait une tache plus large.

    d) Élution de la plaque :

    On place la plaque de CCM en position verticale dans la cuve contenant l'éluant. Le solvant monte le long de la plaque par capillarité. Lorsqu'il arrive presque en haut de la plaque (à environ 1 cm de l’extrémité supérieure), on sort celle-ci de la cuve, on marque la ligne de front (là où l'éluant s'est arrêté de migrer) et on laisse l'éluant s'évaporer à l’air libre ou à l’aide d’un séchoir.

    e) Révélation des taches (lampe U.V ou réactifs chimiques spécifiques) :

    Pour visualiser les différentes taches, on commence par placer la plaque sous une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en vert fluorescent et les produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme de taches sombres. On utilise cette méthode de détection en priorité car elle n'endommage pas la plaque. Dans cet exemple, on voit que le brut réactionnel contient encore du produit de départ (tache 4). On observe la formation d'au moins trois nouveaux produits (1, 2 et 5).

    Dans un deuxième cas, on doit rendre les taches visibles par un procédé de révélation chimique. Par exemple, on plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il existe de nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque jusqu'à ce que des taches colorées apparaissent. Ici on observe un autre produit (3) qui n'était pas visible aux UV. La tache 2 n'était que faiblement visible en UV mais elle révèle très intensément avec la vanilline.

    f) Calcul des R_f et interprétation des résultats :

    Dans une CCM, les composés apparaissent sous forme de taches rondes ou ovales et ces taches sont cerclées au crayon. On peut obtenir parfois des traînées si l’échantillon déposé était trop concentré. Pour une phase stationnaire et une phase mobile données, chaque composé est caractérisé par son R_f (abréviation de « retardation factor »), R_f = distance parcourue par le soluté (d_s)/distance parcourue par le front de l’éluant (d_m)

    La distance parcourue par le composé est calculée à partir du niveau de déposition jusqu’au centre de la tache, tandis que la distance parcourue par l’éluant est calculée à partir du niveau de déposition de l’échantillon jusqu’au front de l’éluant, marqué à la fin de l’élution. Le Rf est un nombre sans unités qui varie entre 0 et 1; il est rapporté à deux décimales près (Ex. : R_f = 0,62).

    
    

     

     

     

     

     

     

     
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    IV. Chromatographie (3) : Chromatographie en phase liquide à haute performance

    La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) — mais on trouve plus fréquemment l'abréviation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) depuis les années 1990 — est une technique de séparation analytique et/ou préparatrice de molécules présentes dans un mélange. Cela permet d'adapter les méthodes chromatographiques usuelles (voir Colonne) sur un montage haute pression. Le P du sigle, à l'origine signifiait Pression mais lorsque la méthode a été améliorée (réduction des particules et régulation de la phase stationnaire) le P a été attribué à Performance afin de marquer cette innovation.

    1. Principe :

    L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelé phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie (les « grains » sont de très petite taille). Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants. En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange augmente si les « grains » qui la composent sont de diamètre plus petit. Les pics obtenus (via un détecteur) sont plus étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien séparés, on peut donc bien les différencier), le seuil de détection est également plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas). La combinaison de ces attributs - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation « haute performance».

    Les phases mobiles utilisées sont des mélanges d'eau et d'un solvant organique miscible (acétonitrile, méthanol) ou des combinaisons de solvants organiques (alcools, hexane, dichlorométhane...) miscibles entre eux.

    Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit « gradient » ou « élution graduée » (en opposition au mode « isocratique », pour lequel la composition de la phase mobile reste la même tout au long de l'analyse).

    2. Appareillage et fonctionnement :

    Le principe d’un chromatographe en phase liquide est représenté sur la figure 1. Les éléments en trait plein permettent d’opérer en régime isocratique (c’est-à-dire à composition de phase éluante constante) ; on peut y adjoindre les éléments en tireté pour permettre la mise en œuvre de l’élution graduée, de l’automatisation des analyses, de l’analyse quantitative et du fractionnement de l’effluent (chromatographie semi-préparative). En général, l’ensemble de ces éléments est piloté à l’aide de microprocesseurs.

    2.1. Systèmes de pompage :

    Toute installation de CLHP comporte au moins une pompe pour forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne dont le remplissage est très compact. Il en résulte une pression importante au niveau de l’injecteur. Celle-ci peut atteindre 200 bars selon le débit imposé à la phase mobile ou sa viscosité ainsi que selon la nature de la phase stationnaire. On utilise des pompes conçues pour maintenir un débit non pulsé et stable, même si la composition de la phase mobile varie.

    Suivant leur conception, les chromatographes comportent une ou plusieurs pompes. Associées à une chambre de mélange située en amont ou en aval, elles permettent de délivrer un éluant de composition fixe (mode isocratique) ou au contraire de composition variable pour faire un gradient d’élution.

    2.2. Dégazeur :

    La présence, dans les solvants, des gaz ambiants (N₂, O₂, CO₂...), dissous en quantité non négligeable, peut perturber les séparations par modification de la compressibilité des éluants et formation éventuelle de bulles. En outre le dioxygène abrège la vie des colonnes et est gênant pour les détecteurs électrochimiques ou photométriques UV. Il est donc préférable de dégazer les solvants, soit avec des ultrasons soit par barbotage d’hélium, soit par diffusion en les faisant passer dans un long tube de petit diamètre en polymère perméable aux gaz.

    2.3. Injecteur :

    Les pressions élevées en tête de colonne, pouvant atteindre 200 bar, interdisent l’utilisation d’une injection par seringue à travers un septum comme en chromatographie en phase gazeuse. L’échantillon est donc injecté à l’aide de vannes à boucle d’échantillonnage interne ou externe. Les vannes peuvent être utilisées soit manuellement, soit commandées par un passeur automatique d’échantillons, soit encore motorisées de façon à ne permettre l’injection que d’une faible partie du contenu de la boucle d’échantillonnage (Figure 2).

    2.4. Colonnes

    La colonne se présente comme un tube, le plus souvent en acier, dont la longueur et le diamètre présentent des différences selon les modèles. Les colonnes « standard » dont le diamètre interne (DI) est d’environ 4,5 mm et la longueur de 10 cm, sont de plus en plus supplantées par des colonnes de plus faibles diamètres, baptisées narrow-bore (DI 2-4 mm), micro-bore (DI 1-2 mm), capillaires remplies (DI 0,1-1 mm).

    Pour une colonne standard, le débit est de l’ordre de 1 mL/min, alors qu’il tombe à quelques µL/min pour une colonne micro-bore, ce qui nécessite des pompes et des détecteurs adaptés – quelques gouttes suffisant pour éluer tous les composés.

    2.4.1. Phases stationnaires :

    Parmi tous les matériaux qui ont été ou sont actuellement utilisés pour la confection des phases stationnaires, le gel de silice tient une place prépondérante. Ce matériau de base est un solide amorphe ayant pour formule de composition SiO₂(H₂O)n (avec n très proche de 0) (figure 3).

    Le gel de silice est un polymère inorganique réticulé. Il comporte des groupements silanols, Si–OH en nombre variable.

    Le gel de silice comporte des pores de tailles différentes. Pour remplir la colonne d’une manière homogène, il est préparé sous forme, soit de microparticules sphériques, soit d’un monolithe poreux (figure 4). Il est nécessaire en effet d’éviter la formation de chemins préférentiels pour la phase mobile et par suite pour les composés qui y sont dissous.

    ·         Les micro-sphères ont un diamètre constant dans une même colonne mais il en existe plusieurs types allant de 1 à 12 µm.

    Les monolithes, apparus plus récemment, sont ainsi nommés parce qu’il s’agit d’un gel de silice formé d’une seule pièce dans la colonne même. La reproductibilité des caractéristiques de ce second type de colonne est plus difficile à maîtriser

    2.4.2. Types de chromatographie selon la phase stationnaire :

    Il y a plusieurs types de chromatographie en phase liquide. La nature de la phase stationnaire dépend du type de chromatographie en phase liquide que l'on veut faire ainsi que de la nature et du nombre de composés que l'on veut séparer.

    a. Chromatographie en phase normale :

    La chromatographie en phase normale (NPLC) est un type de chromatographie qui fait intervenir les interactions polaires, contrairement à la chromatographie en phase inverse (RPLC), qui fait intervenir les interactions hydrophobes. Il s’agit d’un mécanisme de compétition entre la rétention d’un soluté dans la phase stationnaire et l’élution du soluté dans la phase mobile, donc des affinités de chaque analyte envers la phase mobile et la phase stationnaire. On fait donc passer un solvant non polaire ou modérément polaire dans la colonne. Les solutés les plus retenus dans la phase stationnaire seront élués en dernier alors que les solutés les moins retenus seront élués en premier. Différents types d’interactions sont exploités tels que les ponts hydrogène, les interactions dipôle dipôle et les interactions acide-base.

    Phases stationnaires : On peut directement utiliser la silice puisqu’elle contient des groupements silanols (Si-OH) en surface. Chaque type de silice possède ses propres propriétés de séparation. Des types des silices contenant plus de groupement silanols libres (plus acide) ou moins de groupements silanols peuvent aussi être utilisés dépendamment du type de séparation désiré. Dépendamment du type de séparation que l’on désire faire, on doit choisir entre trois classes de silice fonctionnalisée suivant le triangle de sélectivité suivant: Accepteur de proton, Donneur de proton et Interactions dipôle-dipôle.

    Les silices fonctionnalisées les plus souvent utilisées pour la chromatographie en phase normale sont la silice cyanopropylée, la silice aminopropylée et la silice 1,2-hydroxypropylée (diol).

    Phase mobile : Les solvants utilisés sont les mêmes que ceux utilisés pour les autres types de chromatographie. Idéalement, on utilise des solvants peu visqueux, afin de permettre un débit d’éluant plus élevé dans la colonne. De plus, pour faire la chromatographie, le solvant doit absolument être moins polaire que les analytes pour éviter une élution directe des analytes. En général, on utilise l’hexane ou le pentane comme solvant non polaire de base (que l’on appelle le solvant A). Il est possible de jouer sur la polarité de l’éluant en faisant varier la polarité du solvant A. Les solvants polaire, aussi appelé solvants modificateurs (solvant B), communément utilisés sont le chloroforme, le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, , l’éther diéthylique ainsi que des alcools comme le méthanol ou l’isopropanol.

    b. Chromatographie en phase inverse :

    La base d'une phase inverse est une phase normale sur laquelle des chaînes alkyles (ou autres selon la polarité recherchée) ont été greffées au niveau des groupes silanols (end-capping). En général, la phase stationnaire est majoritairement composée de petites particules de silice sur lesquelles on a greffé des fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles à 8 ou 18 atomes de carbones.

    Les fonctions silanols (Si-OH) qui subsistent engendrent des interactions hydrophiles parasites, qui rendent les résultats non reproductibles surtout pour les molécules basiques. Pour éviter cela, la surface de la silice est généralement recouverte par une fonction méthyle et les fonctions silanols ne sont plus libres mais sous la forme (Si-O-CH₃), c'est cette étape que l'on appelle « end-capping ». Les fonctions chimiques utilisées pour le end-capping peuvent toutefois être de nature très diverses et les colonnes de dernières générations résistant à des pH extrêmes sont généralement end-capped avec des fonctions proposant un plus grand gène stérique, tel que le tert-butyle (Si-O-C(CH₃)₃). Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande résolution. Cette phase stationnaire est dite « inverse » car de polaire et hydrophile (sans les « greffes »), la phase devient apolaire et hydrophobe.

    2.5. Détecteur :

    L’analyse par chromatographie a rarement pour but de déterminer la composition totale de l’échantillon, mais plutôt de repérer la présence ou doser un composé présent, pour lequel on a choisi un détecteur bien adapté. Le détecteur universel n’est donc pas indispensable. Dans certains cas, il peut même être un handicap pour la lisibilité du chromatogramme. Plus nettement encore qu’en CPG, les aires relatives des pics d’un chromatogramme n’ont souvent aucun rapport avec la composition molaire ou massique du mélange analysé. Cependant quel qu’il soit, le détecteur doit réunir un certain nombre de qualités : donner pour chaque composé détecté une réponse proportionnelle à sa concentration instantanée, être sensible et avoir peu de bruit de fond, être stable dans le temps.

    Il existe plusieurs types de détecteurs :
    
        détecteurs spectroscopiques :
            par spectroscopie d'absorption : ultraviolet-visible ou infrarouge,
            par spectroscopie de fluorescence ;
        réfractométrie ;
        détecteurs électrochimiques (DEC) :
            ampérométriques,
            coulométriques,
            polarographiques,
            potentiométriques ;
        conductimétrie ;
        UV à barrette de diodes (DAD) ;
        évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL) ;
        détection spectrale avec couplage :
            à la spectroscopie de masse (MS), exemples : chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse et chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse ;
            à la spectroscopie atomique

  • Sélectionner l’activité V. Chromatographie (4) : Chromatographie en phase gazeuse

    V. Chromatographie (4) : Chromatographie en phase gazeuse

    La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une méthode de séparation dont les principes généraux sont les mêmes que ceux énoncés pour la chromatographie en général, c’est-à-dire fondés sur la migration différentielle des constituants du mélange à analyser au travers d’un substrat choisi. La particularité du procédé est d’opérer en totalité sur des produits volatilisés, ce qui implique de maintenir une température minimale convenable, mais sans qu’il y ait volatilisation du substrat, et de travailler en circuit étanche aux gaz. Elle a pris un essor considérable, notamment entre 1960 et 1970, pour devenir l’une des méthodes de séparation les plus utilisées. Nullement concurrente de la chromatographie en phase liquide à haute performance, ni de la chromatographie sur couche mince, elle a son domaine propre. 

    1. Description d’un chromatographe en phase gazeuse

    La colonne est enfermé le substrat qui va engendrer le processus de migration différentielle des éléments du mélange à analyser. Ces éléments, appelés solutés, sont obligés de parcourir la colonne par la poussée d’un gaz inerte, intitulé gaz porteur ou gaz vecteur. C’est donc le cœur du chromatographe, puisque c’est ici que se feront, ou ne se feront pas, les séparations recherchées.

    2. Appareillage :

    En reprenant les diverses parties notées sur la figure 1 nous décrirons successivement les pièces essentielles du chromatographe.

    2.1 Four :

    Sauf pour quelques appareils de recherche, le four des chromatographes (ou l’enceinte à température contrôlée des colonnes) est à bain d’air, pourvu de résistances chauffantes et d’un système de ventilation et de brassage pour l’homogénéisation de la température.

    L’enceinte permet de chauffer la colonne jusqu’à plus de 400 °C. En adjoignant une vanne cryogénique alimentée par N₂ ou CO₂ liquides, l’enceinte peut être régulée à basse température.

    2.2 Alimentation en gaz vecteur :

    Hydrogène, hélium, azote sont les gaz vecteurs les plus utilisés. Ils sont de toute façon prélevés dans une bouteille sous pression contenant du produit de pureté connue.

    La nature du gaz vecteur ne modifie pas de manière significative la séparation des composés par suite de l’absence d’interaction entre gaz et solutés, la température étant le seul facteur de modification important. En revanche, la viscosité et la vitesse du gaz dans la colonne ont une influence sur la dispersion des composés dans la phase stationnaire et sur la diffusion dans la phase mobile, donc sur la sensibilité de la détection.

    La pression en tête de colonne (quelques dizaines à quelques centaines de kPa) est soit stabilisée avec un système mécanique, soit asservie électroniquement afin que le débit demeure constant.

    2.3 Introduction de l’échantillon et chambre d’injection :

    2.3.1 Introduction de l’échantillon : Une très petite quantité d’échantillon en solution (ex. 0,5 µL), est introduite dans l’appareil avec une microseringue dont il existe de nombreux modèles adaptés aux divers injecteurs et colonnes. Pour les échantillons gazeux on utilise des vannes à boucles semblables à celles que l’on rencontre en chromatographie liquide. Pour mieux maîtriser la reproductibilité des injections, on adapte presque toujours un injecteur automatique grâce auquel les mouvements de la seringue sont automatisés.

    2.3.2 Injecteurs : L’injecteur est la porte d’entrée de l’échantillon dans le chromatographe. Il a deux autres fonctions : vaporiser et entraîner en tête de colonne l’échantillon mélangé au gaz vecteur. Les caractéristiques des injecteurs, ainsi que les modes d’injection, diffèrent suivant les types de colonnes auxquels ils sont réunis. La qualité des séparations dépend de cette phase de l’analyse.

    2.4 Colonnes :

    Il existe deux types de colonnes, les colonnes remplies (ou colonnes à garnissage) et les colonnes capillaires (figure  2). Elles n’offrent pas les mêmes performances. Pour les colonnes remplies, la phase stationnaire est immobilisée par imprégnation ou par réaction chimique avec le support poreux. Pour les colonnes capillaires, une faible épaisseur de phase stationnaire est soit déposée, soit greffée sur la surface interne de la colonne.

    2.4.1 Colonnes remplies (à garnissage) :

    Ces colonnes, d’un diamètre de 3.18 ou 6.35 mm et de 1 à 3 m de long, sont fabriquées à partir d’un tube d’acier ou de verre dont la paroi interne est traitée pour éviter d’éventuels effets catalytiques sur l’échantillon. Elles supportent un débit de gaz vecteur allant de 10 à 40 mL/min. Elles contiennent un support poreux et inerte. Il s’agit de solides ayant une surface spécifique de 2 à 8 m²/g qui se présentent sous forme de grains sphériques d’environ 0.2 mm de diamètre. La présence de nombreux groupements silanols confère à tous ces supports une réactivité chimique comparable à celle du gel de silice. Tous ces supports permettent le greffage ou l’imprégnation de la phase stationnaire.

    Bien qu’ayant des performances moins élevées que les colonnes capillaires, elles sont toujours utilisées pour certaines analyses de routine normalisées. Elles sont faciles à fabriquer à façon à partir d’un grand choix de phases stationnaires. Elles ne sont cependant pas adaptées aux analyses de traces actuelles.

    2.4.2 Colonnes capillaires (à tube ouvert) :

    Elles sont généralement en silice fondue de grande pureté. Le diamètre interne de ces colonnes varie de 100 à 530 µm (la précision est de quelques %). La technologie est particulièrement délicate pour obtenir des colonnes parfaitement cylindriques, dont la longueur peut aller jusqu’à 100 m pour une paroi d’environ 50 µm. Elles comportent un revêtement  extérieur brun de polyimide, polymère thermiquement stable (Tmax = 370 ◦C), pour les rendre moins fragiles et pouvoir les enrouler sur elles-mêmes grâce à un support métallique adapté. Quelques fabricants proposent aussi des colonnes faites à partir d’un capillaire en métal (aluminium, nickel ou acier) qui acceptent, si la phase stationnaire le permet, des  températures atteignant 450 ◦C.

    2.5 Phases stationnaires :

    Pour les colonnes remplies, la technique d’imprégnation, de mise en œuvre très simple, permet de choisir de nombreux composés organiques peu volatils à usage de phases stationnaires. Mais, pour les colonnes capillaires, les contraintes de fabrication imposent un choix beaucoup plus limité. Les phases actuelles correspondent à deux principaux types de composés : les polysiloxanes et les polyéthylèneglycols.

    2.5.1 Phases stationnaires apolaires : Suivant la notion de polarité établie, les principales phases apolaires sont à base d’hydrocarbures saturés aliphatiques ou encore de silicones. On choisit des produits à longue chaîne comme le squalane (base de l’échelle de polarité = 0) ou des graisses d’hydrocarbures, ou encore des huiles ou des graisses de silicones faiblement polaires, des huiles fluorées, etc.

    2.5.2 Phases stationnaires polaires : Il s’agit de produits possédant des fonctions plus ou moins réactives, par exemple alcool, ester, éther, nitrile, etc. Étant donné qu’ils doivent avoir une pression de vapeur relativement faible, la plupart des composés proposés sont des polymères : polyols, polyesters, polyamides, polysilicones, etc.

    2.6. Principaux détecteurs :

    Certains détecteurs sont universels, c’est-à-dire qu’ils sont sensibles à pratiquement tous les composés élués, d’autres sont beaucoup plus sensibles à un type particulier de molécules.

    Un détecteur spécifique, qui ne voit que certains produits, donnera un chromatogramme plus simple. À la limite, pour doser un analyte, l’idéal serait de disposer d’un détecteur ne voyant que lui. On peut répartir les détecteurs en deux groupes, ceux qui conduisent aux seuls temps de rétention, et ceux qui donnent, en outre, des informations structurales sur les composés détectés. Tous les détecteurs donnent une réponse qui dépend de la concentration molaire ou massique du soluté dans le gaz vecteur. Plusieurs détecteurs peuvent être associés en série.

    2.6.1 Détecteur à conductibilité thermique (TCD) : Ce détecteur universel, mis au point dès les débuts de la CPG, est longtemps resté incontournable. Son principe repose sur la mesure des variations de conductibilité thermique des mélanges gazeux en fonction de leur composition.

    2.6.2 Détecteur à ionisation de flamme (FID) : Considéré comme pratiquement universel pour les composés organiques, c’est le détecteur par excellence de la CPG actuelle. Le courant gazeux issu de la colonne pénètre dans la flamme d’un petit brûleur alimentée par un mélange d’hydrogène et d’air. Ce détecteur détruit l’échantillon dont la combustion produit des ions et particules chargées, responsables du passage d’un courant ionique extrêmement faible entre deux électrodes.

    2.6.3 Détecteur thermoionique (NPD) : Ce détecteur est très sensible aux composés azotés (N) ou phosphorés (P). À la différence du FID la flamme est plus petite. Les composés contenant N ou P donnent, assez spécifiquement, des fragments de décomposition transformés en ions négatifs. Ces ions sont recueillis sur une électrode collectrice.

    2.6.4 Détecteur à capture d’électrons (ECD) : Il s’agit d’un détecteur considéré comme sélectif car il est beaucoup plus sensible aux dérivés halocarbonés.

    2.6.5 Détecteur à photo-ionisation (PID) : Ce détecteur assez sélectif mais peu répandu, convient aux hydrocarbures ainsi qu’aux dérivés contenant S ou P. Le principe consiste à irradier le composé élué avec une lampe UV émettant des photons très énergétiques. Il s’agit d’un détecteur qui peut fonctionner à plus de 400 ◦C et qui n’est pas destructif, l’ionisation étant réversible et ne touchant qu’une faible fraction des molécules de chaque composé.

    2.6.6. Détecteurs conduisant à des données structurales : Les détecteurs précédents ne donnent pas d’informations sur la nature des composés élués, tout au plus sont-ils sélectifs. Il paraît évident que seules des techniques spectrométriques peuvent répondre à tout ou partie de ces impératifs :

    ·         Chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (CG/SM)

    ·         Chromatographe en phase gazeuse/spectromètre infrarouge (CG/IRFT)

    Chromatographe en phase gazeuse/spectromètre d’absorption atomique (CG/AA)

  • Sélectionner l’activité VI. Electrophorèse 1. Introduction : L’électrophor...

    VI. Electrophorèse

    1. Introduction :

    L’électrophorèse est – avec la chromatographie – la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules.  Le terme « électrophorèse » vient de « electro » signifiant énergie électrique et de « Phoresis » (photos en grec) qui veut dire porter, avoir en soi. Cette méthode s’applique principalement à la biochimie et à la biologie moléculaire et on à une séparation des protéines et des acides nucléiques.

    2. Principe :

    L’électrophorèse est une méthode de séparation des molécules chargées électriquement. On a une séparation puis on a une caractérisation ou une purification de molécules d’intérêts. Son principe consiste à avoir une migration de molécules chargées (perte de neutralité électrique) dissoutes ou en suspension dans un solvant, sous l’effet d’un champ électrique.

    Les molécules à séparer sont déposées sur un support dont chaque extrémité est en contact avec une solution tampon. Dans chaque solution tampon se trouve une électrode. Les électrodes sont reliées à un générateur de courant. Lorsque le générateur envoie du courant, les molécules chargées se déplacent sur le support en direction de l’électrode de signe opposé à leur charge.

    3. Migration et caractéristiques des molécules :

    ·         La charge des molécules est évidemment la caractéristique fondamentale de la migration électrophorétique. Elle détermine la direction d'après sa polarité, vers l'anode ou la cathode, et la vitesse, donc la distance, de migration proportionnellement à la densité de la charge. La charge d'une molécule est dépendante du pH du milieu.

    ·         La taille des molécules a une certaine influence, particulièrement dans le cas où les molécules passent à travers une matrice poreuse.     

    ·         L'affinité des molécules : pour la matrice affecte la migration. Plus l'affinité est grande moins la molécule migre vite et loin, parce qu'elle est retardée.

    4. Différents types d’électrophorèse :

    On à plusieurs supports d’électrophorèse :

    - sur supports liquide : « électrophorèse en veine liquide » pour les très grosses particules (cellules, organites) qui est très peu utilisé.

    - sur supports poreux : « électrophorèse de zone »

    On a différents supports d’électrophorèse de zones :

    ·         papier (acides aminés ou petits peptides)

    ·         acétate de cellulose

    ·         semi solide (gel)

    Le support poreux doit être homogène et le plus inerte possible.                                

    On a plusieurs types d’électrophorèse sur gel :

    ·         Electrophorèse sur gel d’agarose

    ·         Electrophorèse en champ pulsé

    ·         Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (où PAGE pour polyacrylamide gel electrophoersis) : (séparation par purification des protéines  et des oligonucléotides)

    ·         Electrophorèse bi-dimensionnelle

    Les électrophorèses peuvent aussi être réalisé en conditions dénaturantes (détergent types SDS « sodium dodécyl sulfate » ou urée).

    VII. Centrifugation

    1. Introduction

    Une centrifugeuse est un appareil destiné à produire une accélération grâce à un mouvement de rotation. Cette technique permet d'exposer des échantillons à de fortes accélérations qui permettent la séparation des constituants. La centrifugation permet la séparation de : deux phases liquides ; une phase solide en suspension dans une phase liquide ou  deux phases liquides contenant une troisième phase solide.

    2. Principes de base :

    La séparation de mélanges liquides est basée sur leur différence de densité, en exploitant l’accélération centrifuge. Cela n’est possible que si le mélange est en suspension et non en solution.

    3. Appareils :

    Centrifugeuses de table: Elles permettent d'atteindre de faibles accélérations (1000 à 3000 xg) à des vitesses de rotation relativement basses (moins de 1000 RPM).

    Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles permettent d'obtenir des vitesses de rotation de l'ordre de 30 000 RPM.

    Ultracentrifugeuses: Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent d'atteindre des accélérations très élevées (jusqu'à 300 000 RPM).

    Micro-centrifugeuses : Les microtubes à centrifuger sont des petits tubes coniques généralement de 1.5 ml fait de polypropylène. Les centrifugeuses de ce type peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de l'ordre de 12-15 000 x g.

    4. Appareillage :

    Il existe trois grands types de rotor: à angle fixe, à godets mobiles et verticaux.

    ·         Les rotors à angle fixe ("fixed angle") :   sont faits de blocs de métal  avec des puits creusés à l'intérieur et inclinés avec un certain angle par rapport à l'horizontale, généralement de l'ordre de 15° à 35° selon les modèles.

    ·         Les rotors à godets mobiles ("swinging buckets"): Se réorientent lors de la centrifugation.

    ·         Les rotors verticaux : Sont beaucoup moins répandus et sont essentiellement utilisée pour les gradients de type isopicniques ou zonaux. Ils sont utilisés dans la centrifugation en gradient de densité.

    5. Les techniques de centrifugation :

    5.1. Centrifugation en gradients de densité :

     On peut amplifier l'efficacité des méthodes de séparation en centrifugeant dans des gradients de densité. La vitesse de sédimentation d'une particule (organite, macromolécule,...) est fonction de la différence entre sa densité et celle du milieu ambiant. La vitesse de sédimentation peut donc être modifiée en faisant varier de façon continue ou discontinue (par paliers) cette différence en créant un gradient de concentration du milieu ambiant.

    5.2. Centrifugation différentielle :

    Dans ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus souvent à l'aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante.

     6. Manipulations et aspects pratiques :

    On peut fractionner une préparation en un sédiment (ou culot), constitué de matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant qui sera le liquide résiduel au-dessus du sédiment.

     

    La centrifugeuse nécessite :

    ·         Équilibrage des tubes : Comme les rotors sont soumis à des vitesses énormes, il faut équilibrer le poids autour de son axe de rotation.

    ·         Soin des rotors et de la centrifugeuse : Il est crucial de prendre un soin méticuleux des rotors.

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• I.Généralités sur les méthodes spectrales :
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    1. Introduction :

    La spectrophotométrie est l’étude des interactions entre la matière et les radiations électromagnétiques.

    Plusieurs théories ont été développées pour expliquer ce qu’est la lumière :

    ·         La théorie électromagnétique (Maxwell): elle attribue à la lumière  les propriétés d’un rayonnement électromagnétique constituée d’un champ magnétique B^→ et d’un champ électrique E^→ qui lui est perpendiculaire. Ces champs, en un point donné, varient de façon sinusoïdale, en phase.

    ·         La théorie corpuscules associée à la lumière des corpuscules appelés photons, dont l’énergie est proportionnelle à la fréquence des ondes lumineuses.

    2. Ensemble des radiations électromagnétiques :

    On caractérise une radiation par sa fréquence ‘ν’ (exprimé en hertz ‘Hz’) qui définit l’énergie transportée par les photons : ΔE = h ν (où h est la constante de Planck ; h = 6,63 . 10^-34 J.s). on utilise également d’autre grandeurs liées directement à la fréquence des radiations : la période ‘T’ (T = 1/ν), la longueur d’onde ‘λ’ (par mètre), distance parcourue par l’onde pendant une période (λ = cT = c/ν, où c représente la célérité de la lumière dans le vide ; le nombre d’onde ‘σ’, σ = 1/λ (exprimé en cm ^-1).

    3. Interaction des radiations électromagnétiques avec la matière :

    Toutes les interactions se font par échange d’énergie entre le rayonnement et la matière et tout processus favorable d'interaction résulte d'une transition énergétique entre un niveau fondamental et un niveau excité. La répartition de l’énergie dans la matière est :

    -          Energie propre des noyaux (quantifiée).

    -          Energie due aux électrons des atomes ou des molécules (quantifiée).

    -          Energie de vibration des atomes dans une liaison (quantifiée).

    -          Energie de rotation de l’ensemble d’une molécule (quantifiée).

    -          Energie de translation des atomes ou des molécules.

    Dans l’état stable, à basse température, seule les basses énergies sont possibles. On peut augmenter l’énergie de la matière par différents processus : thermiques, électriques, ou électromagnétiques ; c’est l’excitation.

    Le rayonnement incident peut interagir de plusieurs manières avec la matière :

    1.      Réflexion : phénomène de retour d’une onde lorsqu’elle rencontre une surface, transparente ou non, sans la traverser.

    2.      Réfraction : La réfraction est la déviation de la lumière lorsqu'elle traverse l'interface entre deux milieux transparents de densités optiques différentes. Cependant, la dispersion est la séparation des diverses composantes d'une lumière polychromatique par réfraction.

    3.      Diffraction : La diffraction est la déviation de la lumière qui traverse une fente étroite ou qui rencontre un obstacle très petit.

    4.      Diffusion : La diffusion est la dissémination dans toutes les directions de la lumière lorsqu'elle rencontre un milieu constitué de fines particules ou une surface irrégulière. C'est le phénomène de diffusion qui est responsable de la couleur bleue du ciel et de la couleur rouge des couchers de soleil.

    5.      Fluorescence : La fluorescence est l'émission instantanée, de lumière par un corps soumis à un rayonnement. L'émission de lumière se fait donc pendant l'excitation.

    6.      Absorption : L'absorption est le retrait, partiel ou complet, de lumière dans un faisceau lumineux. L'absorption peut se faire lors de la réflexion de la lumière par une surface colorée ou par la transmission à travers un filtre.

    4. Analyse des spectres :

    Dans la plupart des cas, le rayonnement qui interagit avec la matière est complexe : il est formé d’un ensemble de radiations de longueurs d’onde différentes ; on dit qu’il est « polychromatique ».

  • Sélectionner l’activité II. Spectroscopie d’absorption dans l’UV-visible 

    II. Spectroscopie d’absorption dans l’UV-visible 

    La spectrophotométrie UV / Visible est une méthode très commune dans les laboratoires. Elle repose sur l'interaction du rayonnement électromagnétique et de la matière dans le domaine s'étendant du proche UV au très proche IR soit entre 180 et 1100 nm. L'absorbance des composés dans le proche UV et le visible est exploitée en analyse quantitative par application de la loi de Beer-Lambert.

    Domaine spectral : Le domaine spectral concerné est subdivisé en trois plages appelées proche UV, visible et très proche IR (185-400 ; 400-800 ; 800-1100 nm). La plupart des spectrophotomètres commerciaux recouvrent la gamme allant de 190 à 950 nm.

    Principe : L'absorption des rayonnements par les molécules dans cette gamme de longueur d'onde est due au passage du niveau fondamental à un niveau excité sous l’effet du rayonnement ; plus précisément au passage d’un électron d’un niveau électronique à un autre niveau électronique d’énergie supérieure.

    Les spectres dans l'UV / visible : Le document de base fourni par les spectrophotomètres, appelé spectre, correspond au tracé des variations de l’absorbance en fonction de la longueur d'onde des photons incidents. Les spectres dans l’UV / visible donnent la transmittance ou l’absorbance de l’échantillon analysé en fonction de la longueur d’onde du rayonnement ou parfois du nombre d’onde, son inverse. La transmittance, notée T, est donnée par :

    T =  I/I0

    où I0 est l’intensité incidente et I, l’intensité transmise. L’absorbance est définie par :

    A = -logT

    Origine des absorptions : L’absorption dans le domaine UV / visible est due au passage d'un niveau électronique à un autre d’énergie supérieure avec changement des niveaux de vibration et de rotation ; au cours de ce processus, un électron passe d’une orbitale moléculaire à une autre d’énergie supérieure.

    Les transitions électroniques rencontrées en chimie organique sont :

    Transitions σ- σ* : sont situées dans le lointain UV vers 130 nm.

    Transitions n - σ* : Elles correspondent à des longueurs d’onde comprises entre 150 et 250 nm.

    Transitions n - π* : exemple : carbonyle; elle se situe entre 270 et 290 nm.

    Transitions π - π*.

    Instrumentation  dans l’UV/visible : Les spectromètres UV-visible comportent une source de lumière suivie d’un monochromateur, d’un compartiment pour placer les échantillons, puis d’un dispositif de réception associé à un dispositif de traitement des données permettant au final le tracé d’un spectre.

     

     

  • Sélectionner l’activité III. Spectroscopie d’absorption dans l’Infra Rouge

    III. Spectroscopie d’absorption dans l’Infra Rouge

    1. Domaine spectral :

    Le rayonnement infrarouge (IR) est localisé au-delà des longueurs d’onde dans le rouge, sont situées entre la région du spectre visible et des ondes hertziennes. Le domaine infrarouge s’étend de 0,8μm à 1000 μm. Il est arbitrairement divisé en 3 catégories, le proche infrarouge (0,8 à 2,5μm) soit 12500-4000 cm^-1), le moyen infrarouge (2,5 à 25μm soit 4000-400 cm^-1) et le lointain infrarouge (25 à 1000μm soit 400-10 cm^-1).

    2. Principe :

    La spectroscopie IR est basée sur l’interaction de la lumière IR avec le nuage électronique des liaisons chimiques. Dans le cas de la spectroscopie d’absorption IR, le rayonnement émis par la source polychromatique induit des transitions entre les niveaux d’énergie vibrationnelle. Lors de cette interaction il y a émission de radiations à des longueurs d’onde différentes de celle de la radiation incidente.

    3. Molécules polyatomiques

    Seules les liaisons qui présentent un moment électrique dipolaire oscillant sont actives dans l'infrarouge. La figure 01 montre des exemples de quelques modes vibratoires typiques. A chaque mode correspond une fréquence propre fondamentale et plusieurs autres fréquences associées aux harmoniques.

    4. Appareillage

    Il existe deux sortes de spectromètre IR: le spectromètre à balayage et le spectromètre à transformée de Fourier.

    1. Un spectromètre IR à balayage s'agit du modèle le plus classique, semblable aux spectrophotomètres utilisés en spectroscopie UV-visible.

    2. Un spectromètre IR à transformée de Fourier (IRTF) est identique à un spectromètre à balayage le système dispersif est remplacé par un interféromètre (de Michelon) dont la position est ajustée par laser. Ils sont composés des éléments suivants :

    ·         Source : Le choix de la source dépend de la région infrarouge où l’on veut travailler. Cependant, dans la plupart des cas on travaille dans la région appelée infrarouge moyen c’est à dire entre 4000 et 400 cm^-1.

    ·         Echantillon : Le rayonnement IR provenant de la source est polychromatique, tout d'abord séparé en deux faisceaux équivalents dont l'un est focalisé sur une cellule de référence et l'autre sur une cellule contenant l'échantillon, ce dernier traverse alors le compartiment échantillon et grâce à un miroir à secteur tournant est recombiné au faisceau de référence. Ce faisceau recombiné passe ensuite par la fente du monochromateur à réseau.

    ·         Système dispersif : Le monochromateur consiste le plus souvent en un réseau capable de disperser le rayonnement incident en ses diverses longueurs d'onde. Ce réseau est de plus en rotation constante afin de pouvoir focaliser chaque longueur d'onde l'une après l'autre sur un détecteur.

    ·         Détecteur : le détecteur détecte les variations de température et les transforme en variation d’intensité. Cette différence d'intensité permet alors facilement d'obtenir la transmittance (T), qui s'exprime généralement en %.

    L'intensité du faisceau qui arrive au détecteur est traduite sous forme d'interférogramme. Cet interférogramme est ensuite traité par Transformée de FOURIER. C'est un processus mathématique permettant de décomposer un signal complexe, fonction du temps, en une somme de signaux simples de fréquences.

     

  • Sélectionner l’activité IV. Spectrométrie d'absorption atomique

    IV. Spectrométrie d'absorption atomique

    1. Introduction :
    La spectrométrie d’absorption atomique (SAA) étudie les émissions ou absorptions de lumière par l'atome libre. La SAA permet de doser dans pratiquement toute sorte d’échantillon, un ou plusieurs éléments pré-définis (métaux ou non-métaux) choisis dans une liste en contenant environ 70. La sensibilité permet d’atteindre pour certains éléments des concentrations inférieures au µg/L (ppb). Les applications sont très nombreuses.

    2. Principe :

    La spectroscopie d’absorption atomique (SAA) est basée sur le principe que les atomes libres peuvent absorber la lumière d’une certaine longueur d’ondes. L'absorption des radiations électromagnétiques des régions visibles et UV du spectre par les atomes libres résulte d'un changement dans la structure électronique. L’absorption de chaque élément est spécifique, aucun autre élément n’absorbe sa longueur d’ondes. L'intensité de l'absorption dépend directement du nombre de particules absorbant la lumière selon la loi de Beer Lambert. Cependant en pratique, cette relation n'est pas toujours vérifiée. On n'obtient pas toujours une droite d'étalonnage. C'est le cas si la concentration devient trop élevée.

    La SAA est une méthode basée sur un élément unique, utilisée pour reconstituer l’analyse des métaux d’échantillons biologiques, métallurgiques, pharmaceutiques et atmosphériques par exemple. La détermination spectroscopique d’espèces atomiques peut seulement être réalisée à partir d’un échantillon à l’état gazeux, dans lequel les atomes individuels comme l’Ag, l’Al, l’Au, le Fe et le Mg sont nettement séparés les uns des autres.

    3. Appareillage :

    Le dispositif expérimental utilisé en absorption atomique se compose d'une source, d’un atomiseur, d'un monochromateur et d'un détecteur relié à un amplificateur et un dispositif d'acquisition.

    3.1. Source de lumière :

    Le rôle de la source primaire est de produire une radiation lumineuse à la longueur d’onde caractéristique de l’élément à doser (raie d’émission). Les photons émis à cette longueur d’onde caractéristique pourront être absorbés dans l’atomiseur par la raie d’absorption. Un très grand nombre de sources primaires ont été essayées mais, en fin de compte, seulement quelques types de lampes sont d’usage courant en absorption atomique.

    3.1.1. Lampes à cathode creuse (HCL) : Les lampes à cathode creuse (Hollow Cathode Lamps, HCL) sont certainement les lampes les plus répandues, sauf pour certains éléments pour lesquels elles ne donnent pas satisfaction.

    3.1.2. Lampes à décharge sans électrode (EDL) : Il s’est rapidement avéré que les lampes à cathode creuse avaient des performances réduites pour toute une série d’éléments volatils. Bien qu’il existe des lampes à décharge sans électrode (Electrodeless Discharge Lamps, EDL) pour une cinquantaine d’éléments. Les lampes HCL et EDL sont parfaitement complémentaires, les premières donnant d’excellents résultats pour les métaux non volatils, les secondes s’adressant particulièrement bien à l’étude des métaux volatils.

    3.1.3. Super-lampes et ultra-lampes : Un des inconvénients des lampes à cathode creuse est que, lors d’une augmentation de courant, non seulement la lampe s’échauffe trop, mais un phénomène de renversement de raie apparaît.  Un nouveau type de lampes, dérivées de cathodes creuses, est apparu sur le marché il y a quelques années. Il s’agit des super-lampes et des ultra-lampes.

    3.1.4. Lampes à vapeur de mercure : Certains appareils d’absorption atomique sont spécifiques au dosage du mercure. Ils utilisent une lampe à décharge de vapeur de mercure. Ces lampes émettent des raies assez larges et il faut les alimenter par un très faible courant, ce qui peut entraîner un manque de stabilité.

    3.2. Atomisation :

    Rôle de l’atomiseur : La lumière émise par la source primaire passe au travers de la cellule d’absorption (l’atomiseur) où une partie de la lumière incidente est absorbée. Le rôle de l’atomiseur est de produire des atomes, mais ceux-ci doivent se trouver à l’état fondamental pour pouvoir absorber les photons provenant de la source. On distingue essentiellement deux types d’atomiseurs : la flamme et le four en graphite (électrothermique).

    3.2.1. Flamme :

    La technique de spectroscopie d’émission atomique de flamme avait montré depuis longtemps qu’une flamme produite par la combustion d’un gaz (le plus courant étant l’acétylène) avec de l’air produisait des atomes dont une faible proportion est à l’état excité. La majorité des atomes s’y trouvent à l’état fondamental. Les flammes d’absorption atomique ont une forme laminaire, mince (1 mm) mais fort longue (5 à 15 cm).

    Nébuliseur : La solution d'analyse est pulvérisée en un aérosol constitué de fines gouttelettes. Cet aérosol pénètre dans la chambre de nébulisation dont le rôle est de faire éclater les gouttelettes et d'éliminer les plus grosses. Ce brouillard homogène pénètre alors dans le brûleur. Il existe deux principaux type de nébuliseurs, le nébuliseur pneumatique (le plus souvent utilisé en SAA ) et le nébuliseur ultrasonique (rarement utilisé en SAA).

    Gaz : Les gaz qui entretiennent la flamme sont un mélange de comburant et de combustible. Le comburant est le plus souvent l’air et, dans certains cas, le protoxyde d’azote N2O.  Les combustibles sont surtout l’acétylène, parfois le propane ou l’hydrogène. La flamme la plus couramment utilisée est donc la flamme airacétylène (2 500 °C).

    3.2.2.  Four en graphite et atomisation électrothermique

    Nous savons que la nébulisation est peu efficace et que le temps de séjour des atomes dans la zone d’observation d’une flamme est extrêmement court (1 ms). Il a donc fallu trouver un système dans lequel on analyse la totalité de l’échantillon et permettant d’augmenter le temps de séjour des atomes dans la zone d’observation, il s’agit de l’atomisation électrothermiques.

    L’étape d’atomisation permet de dissocier la matrice résiduelle et d’atomiser le plus sélectivement possible l’élément dosé. La température appliquée et la durée de l’étape doivent être suffisantes pour entraîner l’atomisation complète de l’analyte en évitant les effets de mémoire pouvant apparaître ultérieurement.

    Un atomiseur électrothermique fournit une grande sensibilité parce-qu’il atomise l’échantillon rapidement. L’atomisation se produit dans un four de graphite cylindrique, ouvert aux deux extrémités et qui contient un trou au centre pour la présentation des échantillons. Le gaz le plus communément utilisé est l’argon.

    3.3. Monochromateur :

    La lumière qui quitte la source n’est pas monochromatique : c’est un spectre de raies contenant les raies de l’élément à doser, les raies du gaz de remplissage, ainsi que les raies d’éventuelles impuretés. Le rôle du monochromateur consiste à éliminer toute la lumière, quelle que soit son origine, ayant une longueur d’onde différente de celle à laquelle on travaille.

    3.4. Détecteur :

    Le détecteur est situé à la sortie du monochromateur. Son rôle est de mesurer les intensités lumineuses nécessaires au calcul des absorbances. Pratiquement tous les appareils à l’heure actuelle sont équipés d’un tube photomultiplicateur. Ce système de détection convient parfaitement pour tous les spectromètres permettant l’analyse monoélémentaire.

    4. Applications analytiques :

    La spectrométrie d’absorption atomique peut être appliquée au dosage d’une trentaine d’éléments, et cela tout aussi bien au niveau des éléments majeurs (domaine analytique de la SAAF : 0,1 à 10 mg/dm3) que d’éléments traces ou ultratraces (domaine analytique de la SAAE : 0,0001 à 0,1 mg/dm3). La SAA couvre un vaste éventail d’applications : l’analyse des eaux, des tissus végétaux et animaux, des aliments et boissons, des sols, engrais et sédiments, des liquides biologiques, des produits industriels (ciments, verres, métaux, produits pétroliers...).

    La spectrométrie d’absorption atomique est une méthode analytique comparative ; elle implique un étalonnage, et la qualité des résultats dépend de la représentativité des étalons par rapport aux échantillons. L’étalonnage le plus courant s’obtient en mesurant l’absorbance de solutions synthétiques à concentrations progressives en analyte. La concentration de la solution inconnue est alors directement déduite en rapportant sa valeur d’absorbance sur une droite d’étalonnage préalablement établie.

    4.1 Analyses des eaux douces : Dans cette catégorie d’échantillons, nous considérons les eaux de rivières et de lacs, mais aussi les eaux d’égouts, de rejets ménagers et industriels.

    4.2 Analyses des eaux salées : Nous considérons ici les eaux de mer et d’estuaires ainsi que les saumures industrielles.

    4.3 Analyses de solides : Une grande partie des échantillons analysés en SAA sont solides. Les matrices de certains sont presque uniquement minérales (sols, roches, sédiments, poussières, matières en suspension), d’autres ont une dominante organique (certaines matières en suspension, tissus animaux et végétaux, ces deux derniers provenant d’échantillons agroalimentaires).

    4.4 Analyses des liquides biologiques : Dans le domaine de l’analyse médicale, le contrôle des métaux dans les liquides biologiques est très important. Les deux types d’échantillons les plus analysés sont le sang et l’urine.

    4.5 Analyses des liquides agroalimentaires : Les liquides agroalimentaires comprennent toutes les boissons (eaux, vin,  lait, jus de fruits) mais aussi les vinaigres et les huiles liquides à la température ambiante.

     

    5. Application de l’IR à la détermination des fonctions organiques.

    Les spectres IR sont donc tracés dans l’intervalle maximal [400, 4000] (cm^-1), la grandeur portée en ordonnée étant la transmittance T =I/I₀ ou l’absorbance (ou densité optique) A = log I₀/I, I étant l’intensité transmise par l’échantillon et I₀ l’intensité transmise par la référence. Comme pour toutes les techniques de spectroscopie, elle peut être employée pour l'identification de composés ou pour déterminer la composition d'un échantillon.

  • Sélectionner l’activité V. Résonance magnétique nucléaire

    V. Résonance magnétique nucléaire

    I - Introduction

    La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique fondée sur l’absorption du rayonnement électromagnétique par la matière dans un champ magnétique intense, mais la transition provoquée concerne le noyau de certains atomes présents dans la molécule. Elle constitue l’une des plus puissantes méthodes de détermination de la structure des espèces aussi bien organiques qu’inorganiques.

    II - Théorie

    II.1 Principe générale :

    Certains noyaux (possèdent un spin) sont comparables à de petits aimants, qui soumis à un champ magnétique intense peuvent sous l’action d’un champ de radio fréquence (RF) convenable, absorber une certaine quantité d’énergie : c’est le phénomène de résonance. Il se traduit par le passage des noyaux d’un état énergétique favorable à un état énergétique défavorable.

    II.2 Propriétés nucléaires :

    Un noyau possédant un spin non nul se comporte magnétiquement comme un petit aimant.  Les noyaux sensibles qui possèdent un spin nucléaire I égal à ½ comme le proton ¹H, le carbone ¹³C, le phosphore ³¹P, l’azote ¹⁵N ou le fluor ¹⁹F. Les noyaux à spin I supérieur à ½ : le deutérium ²H l’azote ¹⁴N, l’oxygène ¹⁷O ou encore le soufre ³³S. Les noyaux non sensibles (un spin I égal à 0) possèdent tous un nombre de masse et un nombre atomique pairs.

     

    II.3 Interaction spin nucléaire-champ magnétique :

    En l'absence de champ magnétique externe, les moments magnétiques de spin sont orientés au hasard. Par contre, sous l'action d'un champ magnétique statique B₀, un noyau de spin I non nul peut prendre 2I+1 orientations par rapport à la direction de ce champ. Pour exemple, le proton (¹H) qui possède un spin nucléaire I = ½ prend deux orientations:

    m =  +½ lorsque le spin nucléaire est dans la même direction que le champ appliqué, il est alors dans un état énergétique favorable α.

    m = -½  lorsque le spin nucléaire à une orientation antiparallèle au champ appliqué. Il est alors dans une position énergétique défavorable β.

    La différence d’énergie, ΔE, entre les deux états (α et β) dépendra directement de la force du champ magnétique H₀ selon :

    ΔE = (hγB₀)/2π où h est la constante de Plank, γ le rapport gyromagnétique du noyau excité et B₀ l’intensité du champ magnétique.

     

    II.4 Condition de résonance :

    La transition entre deux états demande un apport d’énergie qui est fourni par une radiofréquence. Le passage d’un état α à un état β est appelé "transition énergétique". L’énergie nécessaire est selon l’équation de Bohr : ΔE = (hγB₀)/2π = hν₀. La fréquence du mouvement du proton en rotation est appelée fréquence de Larmor ν₀.

    La résonance consiste donc au passage du noyau d’un état énergétique favorable α (suivant la direction B₀) à un état énergétique défavorable β (antiparallèle à B₀). Cette transition est induite par l’application ponctuelle d’un champ magnétique et de radiofréquence. L’arrêt de l’application de la radiofréquence va permettre le retour à l’équilibre des noyaux, c’est le phénomène de relaxation.

    Le principe de la RMN du proton (RMN¹H) consiste a :

    (1) utiliser un champ magnétique H0 pour orienter les "spins" nucléaires des atomes,

    (2) exciter ces spins par une onde radio a la fréquence de résonance, ce qui fait basculer certains spins.

    III. Principales caractéristiques du signal RMN :

    Chaque signal RMN est caractérisé par plusieurs grandeurs qui sont caractéristiques de :

    ·         Le déplacement chimique exprimé en ppm (partie par millions)

    ·         La constante de couplage dont la grandeur est exprimée en Hertz

    ·         L’intensité du signal

    III.1 Le déplacement chimique :

    La position des différentes raies du spectre RMN est déterminée par rapport à une référence. Dans le cas du proton, on utilise le tétraméthylsilane Si(CH₃)₄ (note TMS). Par commodité, on utilise une échelle de notation : le déplacement chimique noté δ, exprime en partie par million (ppm). Cette valeur définie (δ) la position du signal sur l’axe des fréquences (axe x du spectre), la valeur sera mesurée par rapport au signal référence par la relation suivante : δ =(ν-νréf / νréf) X 10⁶ . ν_ref correspond au déplacement chimique des protons du TMS.

    δ est caractéristique de l’environnement du proton. Les protons de même environnement sont dits magnétiquement équivalents et ont le même δ. Les noyaux ayant des environnements différents sont dits magnétiquement différents. Si un signal sort à un champ voisin de celui de la référence (TMS), on dit qu'il sort à champ fort : il est blindé. Inversement, si un signal sort à un déplacement chimique élevé, on dit qu’il sort à champ faible : le signal est déblindé.

    Le déplacement chimique d’un proton dépend :

    -          essentiellement de la nature de l'atome qui le porte (carbone, azote ou oxygène le plus souvent)

    -          des substituants portés par cet atome

    -          de la nature des atomes adjacents et des substituants portés par ces derniers (OH, Cl, NO₂…)

    Les effets attracteurs (inductif ou mésomère) s’exerçant sur un carbone portant H induisent un déblindage. Un effet donneur induira au contraire un blindage. Un deuxième effet important est la présence d’électrons pi au voisinage du proton étudie (cycle aromatique ou liaison multiple). Les déplacements chimiques nous donnent donc des indications sur l'environnement chimique du groupe auquel appartient le proton considéré. On pourra ainsi identifier des groupes de protons a partir de la valeur de δ.

    III.2 Intensité des signaux :

    L’intensité du signal considéré sera directement proportionnelle au nombre de protons impliqués dans ce signal. L’intégration du signal par rapport à un signal de référence permet alors de déterminer le nombre de protons.

    III.3 Couplage spin-spin :

    Ce couplage est responsable de la subdivision de certaines raies de résonance en multiplets. Dans une molécule, l’énergie de chaque noyau est affectée par l’état de spin de ses voisins. L’influence des noyaux se transmet via les électrons de liaison. Ce type de couplage peut intervenir à travers plusieurs liaisons.

    IV. Appareillage :

    Les éléments suivants sont indispensables pour constituer un spectromètre :

    ·         Un aimant pour produire le champ statique H₀.

    ·         Une source de radiations électromagnétiques de fréquence appropriée (générateur).

    ·         Une unité de balayage de fréquence dans tout le domaine des absorptions.

    ·         Une cellule contenant l'échantillon.

    ·         Un détecteur (récepteur de radiofréquence) qui mesure la quantité de radiation absorbée par la cellule.

    ·         Un enregistreur qui trace l'énergie absorbée en fonction de la fréquence.

  • Sélectionner l’activité VI. Spectrométrie de masse

    VI. Spectrométrie de masse

    1. Introduction :

    La spectrométrie de masse (SM) désigne une méthode de caractérisation de la matière qui repose sur la détermination des masses atomiques ou moléculaires des espèces individuelles présentes dans l’échantillon. Elle est présente dans des secteurs très divers : chimie organique et inorganique, biochimie, chimie clinique et environnementale, géochimie. Elle sert à toutes sortes d’analyses dans le but de déterminer la nature, la composition et même la structure éventuellement d’échantillons divers pour le respect des réglementations et dans l’industrie en général.

    2. Principe de base :

    La spectrométrie de masse est basée sur la détermination des masses des molécules ou atomes présents dans l’échantillon étudié. Pour arriver à ce résultat, on commence par transformer une très petite quantité du composé à analyser en ions par un moyen adapté (bombardement avec des électrons, des atomes, des photons...). Ces ions sont alors soumis, sous un très bon vide, à l’action d’un champ électrique et /ou magnétique selon les cas. Les forces qui s’exercent sur ces ions permettent de déterminer leur rapport masse /charge, donc éventuellement leur nature. Les résultats sont présentés au moyen d’un graphe appelé spectre de masse sur lequel figurent les abondances des ions formés classés par ordre croissant de leur rapport masse/charge.

    Le concept de la méthode apparaît dans la succession d’étapes auxquelles l’échantillon est soumis :

    ➤ Ionisation : l’échantillon porté sous forme de gaz ou de vapeur est ionisé dans la source de l’appareil. De nombreux procédés sont utilisables pour cette première étape. À ce stade, tout composé formé de molécules conduit à un mélange statistique d’ions de fragmentation.

    ➤ Accélération : aussitôt formés, les ions sont extraits de cette partie de l’appareil, focalisés et accélérés par des lentilles électroniques, pour accroître leur énergie cinétique.

    ➤ Séparation : les ions sont alors « filtrés » suivant leur rapport masse/charge par l’analyseur, certains appareils combinant plusieurs types d’analyseurs en série.

    ➤ Détection : après séparation, les ions terminent leur course en venant frapper le capteur d’un détecteur dont le signal est proportionnel aux charges des ions reçus.

    ➤ Affichage du spectre de masse issu du traitement du signal envoyé par le détecteur.

    La spectrométrie de masse est devenue progressivement un moyen d’investigation irremplaçable des composés structurés que l’on rencontre aussi bien en chimie organique qu’en biochimie (notamment en protéomique). Elle s’applique également à l’analyse de la composition élémentaire des milieux inorganiques (technique ICP /SM). Elle permet aussi l’étude des échantillons comportant des mélanges moléculaires, à condition de séparer les composés en amont du spectromètre de masse avec un chromatographe par exemple. Les couplages en ligne CPG /SM ou CLHP /SM font partie des meilleures méthodes d’analyse des mélanges (infimes quantités d’échantillons complexes).

    3. Principes et appareillages de la spectrométrie de masse

    3.1. Les sources

    La source est l’élément du spectromètre de masse qui permet l’évaporation et l’ionisation des analytes contenus dans l’échantillon. Plusieurs méthodes d’ionisation sont disponibles et leur choix d’utilisation dépend des propriétés physicochimiques des molécules à étudier et des renseignements désirés.

    3.1.1. Ionisation et fragmentation par impact électronique : l’ionisation par impact électronique est la plus ancienne et la mieux connue des méthodes d’ionisation (figure 1). La source comprend un filament chauffé qui émet des électrons qui sont accélérés vers une anode, appelée piège ou trappe. Le faisceau d’électrons entre alors en collision avec les molécules sous forme gazeuse présentes dans la source et leur arrache un électron pour former l’ion moléculaire M+., lui-même expulsé vers l’analyseur grâce à une plaque portée à un potentiel positif et appelée repousseur. Cette méthode d’ionisation-fragmentation est particulièrement adaptée aux composés de masse moléculaire faible (inférieure à 1 000 Da), facilement volatilisables et stables à température élevée.

    3.1.2. Ionisation chimique positive : la source d’ionisation chimique est souvent identique à celle utilisée en impact électronique (source combinée) mais le mécanisme d’ionisation est indirect. Un gaz réactant R (ammoniac, méthane, isobutane) introduit dans la source à la pression de 1 mbar entre en collision avec un faisceau d’électrons générés par un filament et accélérés grâce à une différence de potentiels. Trois types de réactions peuvent intervenir : le transfert de proton (M + RH+ ➞ MH+ + R), la formation d’adduits (M + R+ ➞ MR+), et l’abstraction d’hydrure (MH + R+ ➞ M++ RH) (cas des hydrocarbures).Cette méthode d’ionisation est particulièrement adaptée aux composés de masse moléculaire faible (inférieure à 1 000 Da), facilement volatilisables et stables à température élevée.

    3.1.3. Ionisation par électro-nébulisation (ESI) : l’électronébulisation (« electrospray ») peut être utilisée en aval d’un chromatographe en phase liquide. Elle consiste à pulvériser une solution, à ioniser les espèces qui y sont présentes et à en assurer l’évaporation, ceci en appliquant à pression atmosphérique un champ électrique sur un liquide traversant un capillaire (nébuliseur). On applique une différence de potentiel de quelques milliers de volts entre le nébuliseur et une contre-électrode (figure 2). Par exemple, les ions chargés positivement ou négativement présents dans l’électrolyte vont migrer et se séparer à l’extrémité du capillaire, les ions positifs se plaçant à la surface du liquide et les ions négatifs s’accumulant au niveau du capillaire. Les répulsions entre les charges positives tendent à former le cône de Taylor qui se transforme alors en fines gouttelettes au fur et à mesure que le champ augmente. L’échantillon est ainsi pulvérisé sous forme de fines gouttelettes à la sortie du nébuliseur. Le solvant contenu dans les gouttelettes est ensuite progressivement évaporé à l’aide d’un gaz neutre à contre-courant (azote).

     

     

    3.1.4. Ionisation chimique à pression atmosphérique : ou APCI (pour « atmospheric pressure chemical ionization ») (figure 3) elle peut être utilisée en aval d’un chromatographe en phase liquide. Elle consiste, dans un premier temps, à nébuliser à l’aide d’un gaz (azote), une solution contenant les analytes d’intérêt. Cet aérosol est évaporé après son introduction dans un manchon chauffé. Le mélange des gaz de nébulisation et ceux issus de l’évaporation est entraîné vers une électrode à décharge couronne (ou «corona»). Celle-ci, source constante d’électrons, crée un plasma en ionisant le gaz ambiant pour former des ions réactifs (dits « réacta

    3.1.5. La désorption et ionisation par impulsion laser et assistées par une matrice (MALDI)

    La MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) est fréquemment couplée à un spectromètre de masse à temps de vol (TOF pour « time of flight »). Elle permet d’ioniser des molécules de grande taille, peu volatiles et sensibles à la chaleur sans les dégrader. La méthode MALDI-TOF s’applique aux biomolécules plus fragiles comme les peptides, les protéines, les glycoprotéines et les oligonucléotides. L’échantillon est mélangé à la matrice et placé sur une lame. Le dépôt (ou spot) formé est appelé cible. Une source laser est dirigée sur la cible afin d’ioniser les molécules de l’échantillon. Les ions sont ensuite détectés en mesurant le temps que mettent les différentes particules à atteindre le détecteur. La vitesse de chaque particule dépend du rapport masse/charge. Les molécules plus grandes mettront plus de temps à atteindre le détecteur, tandis que les molécules plus petites arriveront plus vite. Une fois l’ion arrivé au détecteur, le signal est amplifié et envoyé à un ordinateur qui traite les données et donne les résultats sous forme de spectre (figure 4).

     

     

    3.2. Les analyseurs de masse :

    L’analyseur de masse correspond à la partie du spectromètre de masse qui sépare les ions formés dans la source en fonction de leur rapport m/z. Plusieurs types d’analyseurs sont disponibles. Leur mode de fonctionnement repose sur l’utilisation de champs électriques et/ou magnétiques.

    3.2.1. Analyseurs utilisant un champ électrique oscillant :

    Le fonctionnement de ce type d’analyseurs (filtre quadripolaire, piège à ions) est fondé sur le mouvement d’ions dans un champ électrique oscillant. En effet, si l’on considère le trajet d’un ion dans une dimension ; placé entre deux électrodes, celui-ci se déplace et est accéléré vers l’électrode de signe opposé. Si la polarité de l’électrode est inversée, l’ion se trouvera être accéléré dans l’autre direction. Lorsque l’amplitude et la fréquence auxquelles le champ électrique est modifié sont suffisantes, l’ion reste confiné entre les deux électrodes.

    • Analyseur-filtre quadripolaire : il est constitué successivement d’une série de lentilles électroniques permettant la convergence et l’accélération des ions sortant de la source, puis d’un quadripôle formé le plus communément de quatre barres entre lesquelles sont établies des différences de potentiels, l’ensemble débouchant sur un détecteur (figure 4).

    • Analyseur-piège à ions : le piège à ions (ou trappe d’ions) est constitué de trois électrodes, une électrode annulaire et deux électrodes « chapeau », ces dernières étant quasiment identiques et de géométrie hyperbolique. L’électrode « chapeau » supérieure possède en son centre une ouverture qui permet l’introduction des ions issus de la source. L’électrode « chapeau » inférieure possède une série de trous permettant l’éjection des ions vers le détecteur. Les spectromètres de masse de type piège à ions sont dédiés aux études structurales.

    3.2.2. Analyseurs utilisant un champ électrique constant – Analyseurs à temps de vol (« time of flight » TOF) :

    Le principe de fonctionnement de ce spectromètre de masse est simple. Généralement un TOF est associé à une source MALDI. Les ions y sont formés dans une région relativement limitée en présence d’un champ électrique qui accélère ces ions sur la longueur de la source avant leur entrée dans l’analyseur proprement dit. Ce dernier est constitué d’un tube de vol, région sans champ et de longueur beaucoup plus élevée que de la source. Les ions sont détectés à l’autre extrémité du tube.

    3.2.3. Analyseurs utilisant un champ magnétique :

    La propriété des champs magnétiques à dévier la trajectoire des ions a été mise à profit dès le début du vingtième siècle pour déterminer la masse des ions. Les champs électriques accélèrent les ions et homogénéisent leur énergie cinétique, le champ magnétique les dévie sur des trajectoires circulaires dont le rayon dépend de leur rapport m/z.

     

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