TP 2.2. EXTRACTION DE L’INVERTASE ET ETALONNAGE D’UNE SOLUTION STANDARD DE GLUCOSE ET FRUCTOSE POUR LA METHODE A L’ACIDE 3,5 DINITROSALICYLIQUE (DNS)
B.GAMMED'ETALONNAGEPOURLAMETHODECOLORIMETRIQUEA L’ACIDE DINITROSALICYLIQUE
En milieu alcalin et à chaud, l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS) jaune est réduit par les oses réducteurs en acide 3-amino 5-nitrosalicylique rouge orangé.
La chimie de la réaction est complexe et la réaction d'oxydoréduction avec les glucides n'est pas stoechiométrique, les courbes d’étalonnage ne passent pas toujours par l’origine. La technique peut-être utilisée pour doser des glucides non réducteurs (saccharose), après hydrolyse.
Matériel et réactifs
- Réactif au DNS : Metttre 150 g de tartrate double de Na et K dans un flacon de 500 ml. ajouter 8 g de NaOH. Dissoudre complètement le mélange (en chauffant doucement) dans 250 ml d’eau distillée. Ajouter doucement 5 g de DNS. Couvrir avec du papier aluminium et attendre la dissolution du DNS. Laisser refroidir et compléter le volume à 500 ml avec de l’eau distillée. Boucher hermétiquement et conserver à température ambiante et à l’abri de la lumière
- Série de tubes à essai
- Bain marie bouillant
- Spectrophotomètre à 540 nm
- Papier aluminium
- Solution de glucose et de fructose à 0,005 mol/L (glucose 1 g + fructose 1 g dans 1000 ml eau distillée)
- Solution de saccharose à 0,1 mol/L (3,42 g de saccharose dans 100 ml eau distillée)
- Tampon acétate de sodium à 0,05M, pH 4,7 (prépartion : 4,1 g d’acétate de Na dans 1 L d’eau distillé et ajuster le pH à 4,7 avec l’acide acétique dilué).
Préparation de la gamme étalon
Réaliser une gamme d'étalonnage selon le tableau ci-dessous:
N° de tube | ET | C3 | C2 | C1 | 5 SM | |
Solution de glucose + fructose à 0,005 mol/L (ml) | 0 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1 | |
Eau distillée (ml) | 1 | 0,6 | 0,4 | 0,2 | 0 | |
Tampon acétate pH 4,7 (ml) |
1 | |||||
Solution de saccharose à 0,1 M (ml) |
1 | |||||
Réactif au DNS (ml) |
3 | |||||
| Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir Ajouter : | |||||
Eau distillée (ml) |
6 | |||||
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances (DO) à 540 nm contre le témoin (tube 0).
Résultats :
- Tracer la courbe d'étalonnage DO = f (nombre de moles de sucre inverti en µM/tube).
- Déterminer l'équation de cette droite d'étalonnage (faites vos calculs sur Excel 2003)
Remarque : vous utliserez cette courbe pour le reste des travaux pratiques d’enzymologie