TP 5. ETUDE DE L'INFLUENCE DU pH ET DE LA TEMPERATURE SUR UNE REACTION ENZYMATIQUE
- Influence du pH : courbe Vi = f(pH)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu thermostaté à 30°C. On fait varier le pH du milieu réactionnel.
Tubes | pH = 2,2 | pH = 3 | pH = 4 | pH = 4,6 | pH = 5 | pH = 6 | pH = 7,8 | |||||||
| B | E | B | E | B | E | B | E | B | E | B | E | B | E |
Saccharose à 0,1 M (en ml) | 0,1 | |||||||||||||
Eau distillée (en ml) | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 |
Tampon pH X (en ml) | 1 | |||||||||||||
| Préincuber 5 min à 30°C | |||||||||||||
Extraitenzymatique dilué (en ml) | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 |
| Agiter, incuber les tubes à essai 8 minutes à 30°C | |||||||||||||
Réactifs au DNS (en ml) | 3 | |||||||||||||
| Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir Ajouter : | |||||||||||||
Eau distillée (en ml) | 6 | |||||||||||||
B = blanc ; E = essai
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances à 530 nm contre le tube 0
Influence de la température : courbe Vi = f (T)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu tamponné pH= 4,7. On fait varier la température du milieu réactionnel.
Tubes | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
| B | E | B | E | B | E | B | E | B | E |
Saccharose à 0,25 M (en ml) | 0,1 | |||||||||
Eau distillée (en ml) | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 | 1,9 | 1,8 |
Tampon pH 4,7 (en ml) | 1 | |||||||||
| Préincuber 5 min à 30°C | |||||||||
Extrait enzymatique dilué (en ml) | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 | 0 | 0,1 |
| Agiter, incuber les tubes à essai 6 minutes à : | |||||||||
| 20°C | 30°C | 40°C | 60°C | 80°C | |||||
Réactif au DNS (en ml) | 3 | |||||||||
| Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir Ajouter : | |||||||||
Eau distillée (en ml) | 6 | |||||||||
Résultats :
-A l'aide de la valeur de l'équation de la droite d'étalonnage déterminée précédemment, calculer les valeurs de Vi pour chacune des expériences.
-Tracer les courbes Vi = f(pH) et Vi = f (T).
-Interpréter l'allure de ces deux courbes.