TP 3. DETERMINATION DE LA VITESSE INITIALE D'UNE REACTION ENZYMATIQUE
- PRINCIPE
On opère en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu tamponnée pH=4,7 et thermostaté à 30°C. On fait varier le temps de contact entre substrat et enzyme.
Condition de mesure d’une vitesse :
Pour pouvoir mesurer la vitesse initiale avec une bonne approximation il faut se trouver dans la zone où la vitesse est constante pendant un temps suffisamment long (2à3min), ce que l’on peut aisément vérifier en enregistrant en continu l’apparition du produit formé (sucres invertis).
MATERIEL ET REACTIFS
- Réactif au DNS
- Extrait enzymatique dilué (invertase)
- Série de tubes à essai
- Bain marie bouillant
- Spectrophotomètre à 540 nm
- Papier aluminium
- Solution de saccharose à 0,1 mol/L
- Tampon acétate 0,05M à pH 4,7
MODE OPERATOIRE : procéder comme suit
N° de tube | C | |||||
Solution de saccharose à 0,1 mol/L ( en ml) | 0,1 | |||||
Eau distillée (en ml) | 1,8 | |||||
Tampon acétate pH 4,7 (en ml) | 1 | |||||
| Préincuber 5 minutes à 30°C | |||||
Réactif au DNS (en ml) | 3 |
| ||||
Extrait enzymatique diluée 100 fois (en ml) | 0,1 | |||||
| Incuber à 30° pendant (en min) | |||||
| 0 | 1 | 5 | 7 | 10 | 15 |
Réactif au DNS (en ml) |
| 3 | ||||
Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir. Ajouter : | ||||||
Eau distillée (en ml) | 6 | |||||
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances à 540 nm contre le tube 0 (incubation 0 min).
RESULTATS
- Tracer la courbe DO = f(t en min)
- Tracer la courbe [P] = f(t en min)
- Calculer la vitesse initiale de la réaction (Vi) en µmol de saccharose hydrolysé.L-1.min-1 ( L = litre de milieu réactionnel)).