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TP 5. ETUDE DE L'INFLUENCE DU pH ET DE LA TEMPERATURE SUR UNE REACTION ENZYMATIQUE
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TP 5. ETUDE DE L'INFLUENCE DU pH ET DE LA TEMPERATURE SUR UNE REACTION ENZYMATIQUE- Influence du pH : courbe Vi = f(pH)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu thermostaté à 30°C. On fait varier le pH du milieu réactionnel.
Tubes
pH = 2,2
pH = 3
pH = 4
pH = 4,6
pH = 5
pH = 6
pH = 7,8
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
Saccharose à 0,1 M (en ml)
0,1
Eau distillée (en ml)
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
Tampon pH X (en ml)
1
Préincuber 5 min à 30°C
Extraitenzymatique dilué (en ml)
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
Agiter, incuber les tubes à essai 8 minutes à 30°C
Réactifs au DNS (en ml)
3
Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir
Ajouter :
Eau distillée (en ml)
6
B = blanc ; E = essai
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances à 530 nm contre le tube 0
Influence de la température : courbe Vi = f (T)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu tamponné pH= 4,7. On fait varier la température du milieu réactionnel.
Tubes
1
2
3
4
5
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
Saccharose à 0,25 M (en ml)
0,1
Eau distillée (en ml)
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
Tampon pH 4,7 (en ml)
1
Préincuber 5 min à 30°C
Extrait enzymatique dilué (en ml)
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
Agiter, incuber les tubes à essai 6 minutes à :
20°C
30°C
40°C
60°C
80°C
Réactif au DNS (en ml)
3
Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir
Ajouter :
Eau distillée (en ml)
6
Résultats :
-A l'aide de la valeur de l'équation de la droite d'étalonnage déterminée précédemment, calculer les valeurs de Vi pour chacune des expériences.
-Tracer les courbes Vi = f(pH) et Vi = f (T).
-Interpréter l'allure de ces deux courbes.
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TP 5. ETUDE DE L'INFLUENCE DU pH ET DE LA TEMPERATURE SUR UNE REACTION ENZYMATIQUE- Influence du pH : courbe Vi = f(pH)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu thermostaté à 30°C. On fait varier le pH du milieu réactionnel.
Tubes
pH = 2,2
pH = 3
pH = 4
pH = 4,6
pH = 5
pH = 6
pH = 7,8
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
Saccharose à 0,1 M (en ml)
0,1
Eau distillée (en ml)
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
Tampon pH X (en ml)
1
Préincuber 5 min à 30°C
Extraitenzymatique dilué (en ml)
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
Agiter, incuber les tubes à essai 8 minutes à 30°C
Réactifs au DNS (en ml)
3
Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir
Ajouter :
Eau distillée (en ml)
6
B = blanc ; E = essai
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances à 530 nm contre le tube 0
Influence de la température : courbe Vi = f (T)
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu tamponné pH= 4,7. On fait varier la température du milieu réactionnel.
Tubes
1
2
3
4
5
B
E
B
E
B
E
B
E
B
E
Saccharose à 0,25 M (en ml)
0,1
Eau distillée (en ml)
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
1,9
1,8
Tampon pH 4,7 (en ml)
1
Préincuber 5 min à 30°C
Extrait enzymatique dilué (en ml)
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
0
0,1
Agiter, incuber les tubes à essai 6 minutes à :
20°C
30°C
40°C
60°C
80°C
Réactif au DNS (en ml)
3
Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir
Ajouter :
Eau distillée (en ml)
6
Résultats :
-A l'aide de la valeur de l'équation de la droite d'étalonnage déterminée précédemment, calculer les valeurs de Vi pour chacune des expériences.
-Tracer les courbes Vi = f(pH) et Vi = f (T).
-Interpréter l'allure de ces deux courbes.
