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TP 4. DETERMINATION DES CONSTANTES CINETIQUES KM ET Vmax D'UNE REACTION ENZYMATIQUE
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TP 4. DETERMINATION DES CONSTANTES CINETIQUES KM ET Vmax D'UNE REACTION ENZYMATIQUE- PRINCIPE
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme à concentration constante, en milieu tamponné pH = 4,7 et thermostaté à 30°C. On fait varier la concentration en substrat. Le temps de contact entre enzyme et substrat étant identique dans chaque tube.
MATERIEL ET REACTIFS
Même materiel et réactifs que peécédemment (Voit TP 2)
MODE OPERATOIRE : Procéder comme suit
N° de tube
0
1
2
3
4
5
Solution de saccharose à 0,1 mol/L ( en
ml)
0
0,05
0,1
0,2
0,4
1
Eau distillée (en ml)
1,9
1,85
1,8
1,7
1,5
0,9
Tampon acétate pH 4,7 (en ml)
1
Préincuber 5min à 30°C
Extrait enzymatique dilué (en ml)
0,1
agiter, incuber 6 min à 30°C
réactif au DNS (en ml)
3
Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir
Ajouter :
Eau ditillée (ml)
6
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances à 540 nm contre le tube 0 (incubation 0 min).
2. RESULTATS
-A l'aide de la valeur de l'équation de la droite d'étalonnage DO = a x n sucre inverti/tube (déterminée la semaine précédente), calculer les valeurs de Vi pour chacune des expériences, à l'aide de la courbe [P] = f(t) tracer la semaine précédente) (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme).
- Calculer les valeurs de [S]i pour chacune des expériences.
- Tracer les courbes Vi = f ([S]i) et 1/Vi = f (1/[S]i).
- Déterminer KM et Vmax.
Remarque: les valeurs de Vi, 1/Vi, [S]i et 1/[S]i seront regroupées dans un même tableau.
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TP 4. DETERMINATION DES CONSTANTES CINETIQUES KM ET Vmax D'UNE REACTION ENZYMATIQUE- PRINCIPE
On mesure la vitesse initiale de la réaction en présence d'enzyme à concentration constante, en milieu tamponné pH = 4,7 et thermostaté à 30°C. On fait varier la concentration en substrat. Le temps de contact entre enzyme et substrat étant identique dans chaque tube.
MATERIEL ET REACTIFS
Même materiel et réactifs que peécédemment (Voit TP 2)
MODE OPERATOIRE : Procéder comme suit
N° de tube
0
1
2
3
4
5
Solution de saccharose à 0,1 mol/L ( en
ml)
0
0,05
0,1
0,2
0,4
1
Eau distillée (en ml)
1,9
1,85
1,8
1,7
1,5
0,9
Tampon acétate pH 4,7 (en ml)
1
Préincuber 5min à 30°C
Extrait enzymatique dilué (en ml)
0,1
agiter, incuber 6 min à 30°C
réactif au DNS (en ml)
3
Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir
Ajouter :
Eau ditillée (ml)
6
Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances à 540 nm contre le tube 0 (incubation 0 min).
2. RESULTATS
-A l'aide de la valeur de l'équation de la droite d'étalonnage DO = a x n sucre inverti/tube (déterminée la semaine précédente), calculer les valeurs de Vi pour chacune des expériences, à l'aide de la courbe [P] = f(t) tracer la semaine précédente) (on considèrera la vitesse de la réaction égale à 0 lorsqu'il y a absence d'enzyme).
- Calculer les valeurs de [S]i pour chacune des expériences.
- Tracer les courbes Vi = f ([S]i) et 1/Vi = f (1/[S]i).
- Déterminer KM et Vmax.
Remarque: les valeurs de Vi, 1/Vi, [S]i et 1/[S]i seront regroupées dans un même tableau.
